免疫膠體金技術(shù)常見影響因素分析

1、.免疫膠體金技術(shù)常見影響因素分析自膠體金作為特殊標(biāo)記物進(jìn)行研究以來,建立的各種免疫膠體金技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡捷等特點(diǎn),在醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、環(huán)境及食品檢測等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。免疫膠體金技術(shù)的反應(yīng)過程是一個(gè)由金顆粒、抗原與抗體動(dòng)態(tài)結(jié)合的反應(yīng)過程,在這個(gè)過程中每個(gè)環(huán)節(jié)的好壞都直接影響試驗(yàn)的成敗。而試驗(yàn)過程中每個(gè)環(huán)節(jié)又受到很多因素的影響和制約,下面將影響免疫膠體金技術(shù)的因素作一分析,為成功制備膠體金檢測產(chǎn)品提供參考。1耗材的選擇1.1不同型號(hào)膜的篩選。硝酸纖維素膜的型號(hào)在試驗(yàn)中至關(guān)重要,作為反應(yīng)載體影響到整個(gè)試驗(yàn)的成敗。不同的生產(chǎn)廠家生產(chǎn)硝酸纖維素膜時(shí)使用的聚合物和表面活性劑的來源、類型和數(shù)量

2、均大不相同,對生產(chǎn)出的膜的性能產(chǎn)生較大影響膜的孔徑和分布結(jié)構(gòu)不同。膜孔徑減小,膜的實(shí)際可用表面積遞增,膜結(jié)合蛋白的量也遞增;膜孔徑越小,層析速度也越慢,金標(biāo)復(fù)合物通過T線的時(shí)間就越長,反應(yīng)也就越充分;因此膜孔徑越小靈敏度越高,但是同時(shí)也減慢了跑板速度,增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì),也就是假陽性越高。用于金標(biāo)免疫快速試驗(yàn)的膜多為硝酸纖維素膜或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜,不同的包被蛋白對膜有特定要求,試驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇適合孔徑大小和分布結(jié)構(gòu)的膜,找到合適的平衡點(diǎn),使膠體金的標(biāo)記物在膜上的流動(dòng)速率為最佳。1.2結(jié)合墊的選擇。結(jié)合墊位于層析系統(tǒng)的中間,一般要求結(jié)合墊的網(wǎng)格均一且非特異性吸附低,

3、能很好地負(fù)載膠體金標(biāo)記物和待檢測樣品,而不被吸附;玻璃纖維素膜具備以上優(yōu)點(diǎn),同時(shí)具有一定的硬度,為試驗(yàn)中常用。1.3樣品墊及吸水紙的選擇。樣品墊和吸水紙位于膠體金免疫層析系統(tǒng)的兩端,對于膠體金層析系統(tǒng)功能的實(shí)現(xiàn)起著舉足輕重的作用。試驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)試紙條檢測樣品的性質(zhì)選擇合適的樣品墊和吸水紙,保證樣品在樣品墊形成的通道中快速地流動(dòng)而不被非特異性地吸附或者改變樣品的性質(zhì)。如檢測樣品為血清,則可選擇網(wǎng)格較疏松的玻璃纖維素膜即可;如果檢測樣品為毒素,則可選擇質(zhì)量好的吸水紙和樣品墊。吸水紙則要有很好的蓄水能力,保證樣品中所用的液體都經(jīng)過膜的反應(yīng)區(qū)而被樣品墊吸收和蓄積。2關(guān)于膠體金的制備制備顆粒均勻、分散度好

4、的膠體金在金標(biāo)免疫快速試驗(yàn)中非常關(guān)鍵,如果金顆粒直徑的變異范圍太大就會(huì)影響到試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性,如果金顆粒的形狀不規(guī)則或粒徑不均一,使得膠體金標(biāo)記物容易解離和沉淀而產(chǎn)生金標(biāo)擴(kuò)散不完全、反應(yīng)區(qū)底色過深和假陽性現(xiàn)象;而且膠體金質(zhì)量不好,膠體金結(jié)合物就不能快速而完整的從玻璃纖維上解離,從而影響試驗(yàn)結(jié)果。膠體金的制備除了保證藥品的質(zhì)量外,制備過程中的細(xì)節(jié)關(guān)乎膠體金制備的成敗。首先是操作環(huán)境和所用容器的清潔度。所有進(jìn)入溶膠內(nèi)的污物都會(huì)干擾膠體金顆粒的生成或使生成的膠體金出現(xiàn)聚堆現(xiàn)象,容器最好經(jīng)酸洗和硅化處理。操作環(huán)境應(yīng)保持清潔無塵粒,最好有專用工作區(qū)。其次,配制溶液均需使用雙蒸水或三蒸去離子水配制,燒

5、制膠體金最好用去離子水。再者是不同的還原劑對膠體金質(zhì)量的影響。膠體金制備基于還原法,改變還原劑的性質(zhì)和濃度,可制備粒徑不同的膠體金懸液。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇膠體金的粒徑,根據(jù)選擇的粒徑確定還原劑,如制備金顆粒直徑在512nm的膠體金溶液用白磷或抗壞血酸還原氯金酸;如制備大于12nm直徑的金顆粒的膠體金則用檸檬酸三鈉還原氯金酸。此外不同的燒制方法、膠體金的制備量、還原劑的加入方式、加熱容器的大小及加熱的時(shí)間等也影響膠體金顆粒的大小和均一性。根據(jù)所需膠體金的粒徑和數(shù)量,結(jié)合自身試驗(yàn)條件選擇合適的膠體金制備方法。3標(biāo)記蛋白與相關(guān)抗原、抗體的制備標(biāo)記蛋白、T線和C線的抗原或者抗體的純度和濃度直接影響金標(biāo)探

6、針的質(zhì)量。獲得純度高、濃度適中的抗原、抗體,關(guān)鍵在于制備和純化方法的選擇及條件的優(yōu)化。試驗(yàn)前須采用高速離心去雜質(zhì),應(yīng)用飽和硫酸銨沉淀、親和層析、透析除鹽等一系列處理方法,盡可能去除單克隆抗體、二抗和相關(guān)蛋白溶液中的高濃度的雜質(zhì)和多余離子,避免其干擾目的蛋白與膠體金的吸附結(jié)合,或?qū)е履z體金粒子的凝聚;特別是硼酸鹽和磷酸鹽不利于膠體金和蛋白的結(jié)合,應(yīng)盡量避免接觸。同時(shí),充分處理各種大分子蛋白,使其盡量分散為單體和具有適當(dāng)?shù)姆肿淤|(zhì)量,提高膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合比,便于與膠體金充分而穩(wěn)定的結(jié)合。4膠體金的標(biāo)記膠體金標(biāo)記的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是標(biāo)記時(shí)的pH和最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量的確定。根據(jù)膠體金標(biāo)記的原理,只有在pH

7、接近和稍高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),膠體金蛋白質(zhì)的吸附力最強(qiáng);pH過高過低都不利于兩者的結(jié)合,因此標(biāo)記時(shí)選擇精密的酸堿度測定儀器或者試紙條,采用不同方法重復(fù)校正,并進(jìn)行梯度試驗(yàn)找到最佳的標(biāo)記pH。溶膠與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例是否合適是影響標(biāo)記成功的一個(gè)重要因素。過多蛋白質(zhì)標(biāo)記,造成浪費(fèi)的同時(shí)引起試紙的拖帶現(xiàn)象;過少蛋白質(zhì)標(biāo)記,導(dǎo)致膠體金標(biāo)記不完全,從而降低試紙的靈敏度及假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)。也需要在試驗(yàn)中進(jìn)行梯度試驗(yàn),反復(fù)比較不同標(biāo)記量的標(biāo)記物在破壞試驗(yàn)中的穩(wěn)定性,確定最佳的標(biāo)記量。5膜包被條件的優(yōu)化處理膜的包被條件,包括膜的封閉、環(huán)境的濕度、T線和C線上抗原或抗體的濃度、點(diǎn)膜條件、溫度、包被時(shí)間等,需要

8、結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行反復(fù)調(diào)整。包被過程中需要特別注意以下兩點(diǎn):膜上T線和C線抗原或抗體的包被量要相對飽和;包被后的膜一定要在適宜的溫度下徹底干燥,否則會(huì)造成拖帶、顯色不清晰,靈敏度也大受影響。5.1封閉對使用的膜進(jìn)行處理。特別是進(jìn)行封閉是一個(gè)十分有爭議的問題,理論上來說購買回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的,直接點(diǎn)膜就可使用。如果點(diǎn)膜前將膜浸泡在封閉液內(nèi)進(jìn)行封閉處理,必然擾亂了膜內(nèi)正常的物質(zhì)分布,由此引發(fā)了許多不必要的麻煩。但是如果在實(shí)際的試驗(yàn)操作過程中,發(fā)現(xiàn)沒有進(jìn)行封閉的膜出現(xiàn)非特異性條帶或者出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象,或遇到膜不封閉就無法將蛋白質(zhì)或抗體包被在膜上的問題,就應(yīng)考慮封閉問題。建議在制作試紙條過

9、程中根據(jù)各自標(biāo)記物的性質(zhì)及其在膜上的顯色情況來選擇封閉與否,如果標(biāo)記效果比較好且在膜上顯色清晰而無拖帶及假陽性現(xiàn)象出現(xiàn),則完全沒有必要進(jìn)行膜的封閉。反之,可進(jìn)行膜的封閉,查找不理想現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。用來對膜進(jìn)行封閉的物質(zhì)很多,多選用大分子蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEGMW20000)等。常用的封閉方法有流動(dòng)封閉和膜上定點(diǎn)封閉,前者將封閉物處理在樣品墊上,后者將作用物質(zhì)配成溶液噴涂在膜的特定位置上。5.2環(huán)境濕度環(huán)境濕度對點(diǎn)膜過程非常重要。最佳濕度一般在45%65%。濕度過低,膜上容易聚集靜電荷,點(diǎn)膜容易出現(xiàn)散點(diǎn),導(dǎo)致測試時(shí)出現(xiàn)疏水斑;濕度過高,膜上毛細(xì)作用加強(qiáng),點(diǎn)膜容易引起T線

10、、C線變寬甚至擴(kuò)散。為了保證點(diǎn)樣時(shí)膜濕度的均一性,一般在點(diǎn)樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時(shí)間。5.3T線和C線上抗原或抗體的濃度。T線和C線上抗原或抗體的包被濃度直接影響其與金標(biāo)記物的結(jié)合比例,最終影響試紙條條帶的顯色效果。包被濃度過低,膜上的條帶顯色不清晰或出現(xiàn)條帶中空現(xiàn)象;包被濃度過高,會(huì)導(dǎo)致C線不顯色或者出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象。若要獲得反應(yīng)穩(wěn)定、顯色清晰的試紙條,須對2條線上抗原或抗體的配合濃度及兩者與金標(biāo)記物的結(jié)合比進(jìn)行調(diào)整和比對,以期得到最佳的組合。5.4點(diǎn)樣位置。不同的T線、C線點(diǎn)樣位置將帶來不同的靈敏度,點(diǎn)樣位置上移,金標(biāo)復(fù)合物通過T線位置時(shí)速度變慢,反應(yīng)時(shí)間增加,靈敏度升高;反之靈敏度

11、降低?？刹捎眠@個(gè)方法來改變靈敏度和消除假陽性。5.5點(diǎn)樣儀器。目前有2種點(diǎn)樣方式,劃膜式和非接觸點(diǎn)膜式。非接觸點(diǎn)膜式優(yōu)于劃膜式,劃膜式需用軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質(zhì)較為軟脆,劃管會(huì)在其表面留下印痕。劃痕容易對層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力,導(dǎo)致假陽性,同時(shí)容易出現(xiàn)跑板時(shí)在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細(xì)線,影響結(jié)果的判定。點(diǎn)樣儀器不僅可以控制T線、C線點(diǎn)樣位置,也可通過點(diǎn)膜儀器各種參數(shù)的調(diào)整控制T線與C線寬度及噴膜速度等細(xì)節(jié),達(dá)到最好顯色效果。需要在試驗(yàn)過程反復(fù)調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)做比對試驗(yàn),觀察試紙條的顯色情況來決定。6緩沖液緩沖液構(gòu)成膠體金免疫層析技術(shù)的液相載體,在不影響膠體金與蛋白質(zhì)、抗原與抗

12、體、硝酸纖維素膜與T線及C線蛋白結(jié)合的前提下,并為它們的結(jié)合反應(yīng)提供最佳的酸堿環(huán)境。緩沖液并不是通用的,不同的反應(yīng)體系需要不同的緩沖液來支持,這就需要試驗(yàn)者結(jié)合自己的試驗(yàn)嘗試不同的緩沖液,確定適合自己的緩沖液配方。常用的緩沖體系是在選用的緩沖液(磷酸鹽、硼酸鹽等)中添加相應(yīng)的作用物質(zhì)配制而成,所謂作用物質(zhì)是解決反應(yīng)體系出現(xiàn)的某一特定問題而添加的相應(yīng)物質(zhì)。比如通過在緩沖液中添加適量的表面活性劑,可起到增加親水力、增色和避免線條中空現(xiàn)象;也可同時(shí)添加幾種物質(zhì),通過它們之間的相互協(xié)同作用共同解決相關(guān)的問題,如少量NaCl,減少信號(hào)強(qiáng)度,消除假陽性;糖和聚乙二醇作為保護(hù)劑,能減緩老化速度,也可以增加親

13、水力,但也要注意作用物質(zhì)的添加宜簡不宜繁。試紙條制備過程中的很多處理液都是在選擇的緩沖液的基礎(chǔ)上添加相應(yīng)的作用物質(zhì)配置而成的(如封閉液、結(jié)合墊處理液等)。7樣品的處理與結(jié)果的判定7.1樣品的處理方法和加樣量。臨床送檢標(biāo)本(如全血、血清、血漿),不同的單位和檢測人員采用的處理方法不統(tǒng)一,也會(huì)對結(jié)果判定造成影響。如血漿內(nèi)大量的纖維蛋白原,影響到層析的速度及均一性,直接影響到抗原抗體結(jié)合,處理不當(dāng)甚至出現(xiàn)一種非特異性結(jié)合。檢測時(shí)樣品的添加量要相對充足,使膜上的反應(yīng)充分進(jìn)行,以便得到清晰的結(jié)果。加樣量過低,會(huì)導(dǎo)致樣品在試紙條上層析不充分而出現(xiàn)假陰性。7.2結(jié)果的判定。由于使用膠體金產(chǎn)品的工作人員分布在

14、不同的層次、不同的部門,判定結(jié)果時(shí)有很大的隨意性,判定時(shí)間不統(tǒng)一,特別是在工作環(huán)境、溫度、濕度的影響下,根據(jù)標(biāo)志線的顯色時(shí)間隨意判定結(jié)果,而忽略了廠家制定的有效時(shí)間。因此在檢測時(shí)要求工作人員能及時(shí)分辨出試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的假陽性、假陰性現(xiàn)象及異常條帶,能在查找原因后復(fù)檢或結(jié)合相關(guān)的檢測方法重新檢測進(jìn)行比對和確認(rèn),避免漏檢和錯(cuò)檢。8產(chǎn)品的保存和驗(yàn)證8.1產(chǎn)品的儲(chǔ)存。剛生產(chǎn)出的試紙條或檢測卡一般含有5%10%的水分,儲(chǔ)存過程中環(huán)境過干過濕都不利于產(chǎn)品的儲(chǔ)存。環(huán)境過干膜上的水分蒸發(fā),會(huì)使膜變得疏水、帶電荷并變脆;環(huán)境過濕影響金標(biāo)記物的質(zhì)量及T線、C線的顯色效果;因此成品的試紙條和檢測卡應(yīng)進(jìn)行防潮設(shè)計(jì),存放時(shí)間過長時(shí)一般要求避光、密封保存。環(huán)境的溫度也影響標(biāo)記物、抗原、抗體的生物活性,在低溫條件下可有效延長產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間。8.2成品驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)包括特異性試驗(yàn)、線性靈敏度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、樣品檢測、干擾試驗(yàn)、批間批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)等10個(gè)試驗(yàn),綜合評定產(chǎn)品的質(zhì)量。成品驗(yàn)證試驗(yàn)需要的時(shí)間比較長,特別是產(chǎn)品的穩(wěn)定性試驗(yàn)需要在很長的時(shí)間內(nèi)定期抽樣檢測。應(yīng)結(jié)合自己的試驗(yàn),參照相應(yīng)的國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),制定針對性的試驗(yàn)檢測成品的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性及靈敏度等指標(biāo),為進(jìn)一步的優(yōu)化和最終制成優(yōu)質(zhì)的檢測試紙條或