分子生物學常用檢測技術(shù)PPT學習課件

1、分子生物學常用檢測技術(shù) 及臨床應用 DNADNA四種核苷酸（四種核苷酸（A-T-C-G)A-T-C-G)組成的多聚組成的多聚 骨架骨架 所有組成所有組成DNADNA的核苷酸的核苷酸dATP,dTTP, dATP,dTTP, dCTP,dGTPdCTP,dGTP 都由三種成分組成：都由三種成分組成： 1 1）一個）一個2 2- -脫氧核糖（戊糖）脫氧核糖（戊糖） 2 2）一個含氮堿基）一個含氮堿基 嘌呤：嘌呤：AG AG 嘧啶：嘧啶：T/CT/C 3 3）三個磷酸基團）三個磷酸基團 各單個核苷酸由各單個核苷酸由5 5和和3 3- -碳形成的磷碳形成的磷 酸二酯鍵連接在一起酸二酯鍵連接在一起 變性

2、、復性、退火和淬火 基因 分子生物學常用技術(shù) 1. PCR（聚合酶鏈式反應） 2. 核酸分子雜交 3. 基因芯片技術(shù)(biochip) 4. DNA 測序（DNA sequencing ） 5. DNA重組技術(shù)(DNA recombination) 一、聚合酶鏈反應 （Polymerase Chain Reaction ，PCR） 體外基因擴增技術(shù)體外基因擴增技術(shù) 特異性強 靈敏度高 操作簡單、省時 對待檢原始材料質(zhì)量要求低 高效率的基因擴增技術(shù) （一）PCR原理 原理 雙鏈DNA 變性 退火 鏈延伸 （膜板） （雙鏈分成單鏈） （膜板與引物雜交） （DNA合成） 不斷重復 （二）PCR反應的

3、設(shè)計及影響因素 PCR的種類 熒光定量PCR 通用引物PCR 多重PCR 巢式PCR RT-PCR 原位PCR 免疫PCR TaqManTaqMan探針探針 reverse primer R Q forward primer 3 3 5 53 5 5 1. Polymerisation probe R Q 3 3 5 53 5 5 2. Strand displacement Q 3 3 5 53 5 5 3. Cleavage R 3 5 53 5 5 4. Polymerisation completed Q R R = Reporter Q = Quencher 3 熒光定量PCR 定量

4、定量PCRPCR的數(shù)學原理的數(shù)學原理 PCR 理 論 方 程 N = N0 x (1+E)n N：擴增數(shù)量 N0：起始模板數(shù)量 E：擴增效率 N：循環(huán)數(shù) 循環(huán)數(shù) 線性增長期Linear 平臺期Plateau y = N0 (1+e)n 指數(shù)增長期指數(shù)增長期GeometricGeometric 定量定量PCRPCR的數(shù)學原理的數(shù)學原理 Rn (熒光強度) 循環(huán)數(shù)Cycle Number 指數(shù)增長期 平臺期 CT = - k logN0 + b Ct（Cyclethreshold）值：是指每個反 應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定域值 （threshold）時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 PCR的臨床應用 l對病原微生

5、物核酸進行快速檢測 l彌補免疫檢測的缺陷 l縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV） l用于藥物療效監(jiān)測和評估 l用于腫瘤基因表達方面的研究 l用于遺傳病的診斷 項目項目標本采集 HBVHBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。 HCVHCV EBEB1.鼻咽拭子或體液標本。 2.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。 CMVCMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。 2. 其他體液標本或咽拭子。 3. 也可取抗凝血標本,但一般不推薦。 TBTB1.痰液：患者深部咳痰13ml于無菌加蓋試管。 2.其他組織標本：留于無菌試管。 3.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。 MP 呼吸道病毒

6、呼吸道病毒 咽拭子 樣本采集要求 項目項目標本采集標本采集 所需容器所需容器 CTCT男性：男性： 尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約2 24 4厘米，旋厘米，旋 轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜）。轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜）。 前列腺液、精液。前列腺液、精液。 女性：女性： 陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物， 再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5 5秒后旋動棉拭子采取秒后旋動棉拭子采取 分泌物。分泌物。 尿道分泌物：同上尿道分泌物：同上 一次性無菌一次性無菌 帶蓋的試管。帶蓋的試管。 N

7、GNG UUUU TP HPVHPV HSVHSV 二、核酸分子雜交 根據(jù)根據(jù)核酸變性和復性的原理核酸變性和復性的原理， 不同來源的變性單鏈核酸分不同來源的變性單鏈核酸分 子在合適的條件下，通過子在合適的條件下，通過堿堿 基互補基互補形成雙鏈雜交體的過形成雙鏈雜交體的過 程稱為程稱為核酸分子雜交核酸分子雜交 （molecular hybridization）。）。 1、遺傳病的診斷 2、病原體的鑒定 3、癌基因突變的檢測 4、組織配型 5、親子鑒定 核酸分子雜交的臨床應用 三、基因芯片技術(shù) 基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、 硅膠晶片、微型磁珠等。 用點樣法固定在玻璃 板上的DNA探針陣列

8、原位合成法在玻璃等硬質(zhì)表 面上直接合成的寡核苷酸探 針陣列 基因芯片技術(shù)的應用 1、藥物篩選和新藥開發(fā) 2、疾病診斷 3、環(huán)境保護 4、司法 5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 四、測序技術(shù) CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT （一）一代測序技術(shù) （二）二代測序技術(shù) Illumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序 機器，這兩個系列的技術(shù)核心原理是相同的。 Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。 在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種 不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補

9、鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出 不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲得 待測DNA的序列信息。 技術(shù)特點比較 第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達1000bp，準確性 高達99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重 影響了其真正大規(guī)模的應用。 第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測 序速度，并且保持了高準確性，但在序列讀長方面比起第一代 測序技術(shù)則要短很多。 五、基因重組技術(shù) 基因重組是指一個基因 的DNA序列是由兩個或 兩個以上的親本DNA組 合起來的。 基因重組是遺傳的基本 現(xiàn)象，病毒、原核生物 和真核生物都存在基因 重組現(xiàn)象

10、。 轉(zhuǎn)基因植物 （抗蟲、抗凍、抗病、高產(chǎn)） 轉(zhuǎn)基因動物 基因工程藥物和疫苗 基因治療 基因重組技術(shù)的應用 小結(jié) 疾病的診斷 感染性疾病診斷 腫瘤性疾病診斷 遺傳性疾病診斷 組織配型和器官移植 基因治療 基因工程產(chǎn)品 轉(zhuǎn)基因植物 轉(zhuǎn)基因動物 基因工程藥物和疫苗 法醫(yī)學方面 分子生物學技術(shù)的臨床應用 用途廣泛 功能強大 基因工程的危險性 基因的世界很奇妙， 期待你的關(guān)注和參與！ TaqManTaqMan探針探針 reverse primer R Q forward primer 3 3 5 53 5 5 1. Polymerisation probe R Q 3 3 5 53 5 5 2. Str

11、and displacement Q 3 3 5 53 5 5 3. Cleavage R 3 5 53 5 5 4. Polymerisation completed Q R R = Reporter Q = Quencher 3 熒光定量PCR 二、核酸分子雜交 根據(jù)根據(jù)核酸變性和復性的原理核酸變性和復性的原理， 不同來源的變性單鏈核酸分不同來源的變性單鏈核酸分 子在合適的條件下，通過子在合適的條件下，通過堿堿 基互補基互補形成雙鏈雜交體的過形成雙鏈雜交體的過 程稱為程稱為核酸分子雜交核酸分子雜交 （molecular hybridization）。）。 （二）二代測序技術(shù) Illumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序 機器，這兩個系列的技術(shù)核心原理是相同的。 Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。 在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種 不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出 不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而