微生物學：第六章微生物的生長與控制

1、1 微生物學微生物學 袁袁 美美 妗妗 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室有害生物控制與資源利用國家重點實驗室 研究方向：桿狀病毒基因工程研究方向：桿狀病毒基因工程 辦公室地址：曾憲梓北樓辦公室地址：曾憲梓北樓513 Email： 第六章第六章 微生物的生長及其控制微生物的生長及其控制 2 概概 述述 一個微生物細胞一個微生物細胞 合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行代謝合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行代謝 個體的生長個體的生長 原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┎粩嘣黾釉|(zhì)的總量（重量、體積、大?。┎粩嘣黾?繁殖繁殖 引起個體數(shù)目的增加引起個體數(shù)目的增加 群體內(nèi)各個個體的進一步生長群體內(nèi)各

2、個個體的進一步生長 群體的生長群體的生長 如果合成代謝的速度超過了分解代謝如果合成代謝的速度超過了分解代謝 如果各細胞組分是按恰當?shù)谋壤鲩L，則達如果各細胞組分是按恰當?shù)谋壤鲩L，則達 到一定程度后到一定程度后 3 生長生長：生物個體物質(zhì)有規(guī)律地增加，導致生物個體物質(zhì)有規(guī)律地增加，導致個體原生質(zhì)的總個體原生質(zhì)的總 量量（重量、體積、大?。ㄖ亓?、體積、大小）不斷增加不斷增加的生物學過程。的生物學過程。 繁殖繁殖：生物個體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生物個體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的 生命個體，即引起生命生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加個體數(shù)量增加的生物學過程。的生物學過程。

3、在高等生物里這兩個過程可以明顯分開，但在低等特別是在高等生物里這兩個過程可以明顯分開，但在低等特別是 在單細胞的生物里，由于細胞小，這兩個過程是緊密聯(lián)系在單細胞的生物里，由于細胞小，這兩個過程是緊密聯(lián)系 又很難劃分的過程。又很難劃分的過程。 4 群體生長群體生長 = = 個體生長個體生長 + + 個體繁殖個體繁殖 在微生物學中提到的在微生物學中提到的“生長生長”，一般均指，一般均指群體生長群體生長， 這一點與研究大生物時有所不同。這一點與研究大生物時有所不同。 個體生長個體生長 個體繁殖個體繁殖 群體生長群體生長 5 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長

4、的主要因素 微生物的生長規(guī)律微生物的生長規(guī)律 微生物的生長及其控制微生物的生長及其控制 微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)法概論 微生物的微生物的 新陳代謝新陳代謝 有害微生物的控制有害微生物的控制 6 第一節(jié)第一節(jié) 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 微生物的生長繁殖：單位時間里微生物數(shù)量微生物的生長繁殖：單位時間里微生物數(shù)量 或生物量（或生物量（Biomass）的變化，通過此類指）的變化，通過此類指 標可以反映微生物的生長狀況，如：標可以反映微生物的生長狀況，如： 評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響； 評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制（或殺死

5、）評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制（或殺死） 作用的效果；作用的效果； 客觀地反映微生物生長的規(guī)律。客觀地反映微生物生長的規(guī)律。 研究意義（見研究意義（見P151） 7 依據(jù)依據(jù)：生長：生長 原生質(zhì)含量的增加原生質(zhì)含量的增加 方法方法：直接法、間接法：直接法、間接法 一、測生長量一、測生長量 （一）直接法（一）直接法 1. 測體積法（粗放）：測體積法（粗放）： 用刻度離心管將微生物離心，測沉降量用刻度離心管將微生物離心，測沉降量 8 2. 稱重量法（精確）稱重量法（精確） 微生物細胞微生物細胞 （單細胞、多細胞及絲狀菌體）（單細胞、多細胞及絲狀菌體） 固固/液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 收集濕菌體收集濕

6、菌體 烘干至恒重烘干至恒重 干細胞干細胞 （10%-20%） 離心、過濾、洗滌離心、過濾、洗滌 105 高溫烘干高溫烘干 低溫真空干燥低溫真空干燥 紅外線快速烘干紅外線快速烘干 細胞干重細胞干重 細胞濕重細胞濕重 1 E.coli2.810-13g 9 （二）間接法（二）間接法 用分光光度計（用分光光度計（450-650波段）波段） 測定微生物懸浮液的光密度測定微生物懸浮液的光密度 (optical density, 即O.D.) ，以，以 O.D.值表示菌量值表示菌量 1. 比濁法比濁法 10 （二）間接法（二）間接法 2. 生理指標法生理指標法 微生物的很多生理指標與微生物生長量相平行。微

7、生物的很多生理指標與微生物生長量相平行。 應(yīng)用于生長量測定的常用指標有：應(yīng)用于生長量測定的常用指標有： 測含氮量法：測含氮量法： 細菌含氮量為干重的細菌含氮量為干重的12.5%，酵母為，酵母為 7.5%，霉菌為，霉菌為6.5% 測碳、磷、測碳、磷、DNA、RNA、ATP、DAP、幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)、N- 乙酰胞壁酸含量乙酰胞壁酸含量 測產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、耗氧、黏度和產(chǎn)熱等指標測產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、耗氧、黏度和產(chǎn)熱等指標 11 依據(jù)依據(jù)：繁殖：繁殖 個體數(shù)目的增加個體數(shù)目的增加 方法方法：直接法、間接法：直接法、間接法 二、計繁殖數(shù)二、計繁殖數(shù) 用途：用途：通常用來測定細菌、酵母菌等單細胞微生通常用來測定細菌、酵

8、母菌等單細胞微生 物的生長情況或樣品中所含微生物個體的數(shù)量物的生長情況或樣品中所含微生物個體的數(shù)量 （細菌、酵母菌、以及放線菌或酵母菌的孢子）（細菌、酵母菌、以及放線菌或酵母菌的孢子） 12 二、計繁殖數(shù)二、計繁殖數(shù) （一）直接法（一）直接法 用細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板在光學顯微鏡下直用細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板在光學顯微鏡下直 接觀察并計數(shù)接觀察并計數(shù) 13 傳統(tǒng)直接計數(shù)法的優(yōu)缺點傳統(tǒng)直接計數(shù)法的優(yōu)缺點 優(yōu)點：優(yōu)點：快速簡便，還可知細胞的形態(tài)特征快速簡便，還可知細胞的形態(tài)特征 缺點：缺點： 不能區(qū)分死菌與活菌不能區(qū)分死菌與活菌 不適于對運動細菌的計數(shù)不適于對運動細菌的計數(shù) 個體小的細菌在顯微鏡下難

9、以觀察個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察 需要相對高的細菌濃度需要相對高的細菌濃度 改改 進進 用特定的染色計數(shù)用特定的染色計數(shù) 加入甲醛等物質(zhì)破壞運動細菌的運動性加入甲醛等物質(zhì)破壞運動細菌的運動性 用細菌計數(shù)板比血球計數(shù)板更合適用細菌計數(shù)板比血球計數(shù)板更合適 當樣品中菌數(shù)很低時，可以用濾膜法計數(shù)當樣品中菌數(shù)很低時，可以用濾膜法計數(shù) （一）直接法（一）直接法 14 濾膜法濾膜法 當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲 用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng) 處理使膜透明，再在

10、顯微鏡下計算膜上處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積中或一定面積中)的的 細菌數(shù)。細菌數(shù)。 15 二、計繁殖數(shù)二、計繁殖數(shù) （二）間接法（二）間接法活菌計數(shù)法活菌計數(shù)法 原理：原理：每一個單個的微生物在合適的培養(yǎng)基和生長每一個單個的微生物在合適的培養(yǎng)基和生長 條件下，可以在平板上（內(nèi)）通過生長形成菌落。條件下，可以在平板上（內(nèi)）通過生長形成菌落。 通過計算菌落的數(shù)量，可以計算樣品中的活菌數(shù)。通過計算菌落的數(shù)量，可以計算樣品中的活菌數(shù)。 1. 平板菌落計數(shù)法平板菌落計數(shù)法 澆注平板法澆注平板法（pour plate） 涂布平板法涂布平板法（spread plate） 16 17 采用培

11、養(yǎng)平板計數(shù)法要求：采用培養(yǎng)平板計數(shù)法要求： 操作熟練、準確，否則難以操作熟練、準確，否則難以 得到正確的結(jié)果，注意事項得到正確的結(jié)果，注意事項： 樣品充分混勻樣品充分混勻 每支移液管及涂棒只能接每支移液管及涂棒只能接 觸一個稀釋度的菌液觸一個稀釋度的菌液 同一稀釋度要三個以上重同一稀釋度要三個以上重 復復,取平均值取平均值 每個平板上的菌落數(shù)目合每個平板上的菌落數(shù)目合 適，一個適，一個9cm直徑平板上一直徑平板上一 般以般以50500個為宜，便于準個為宜，便于準 確計數(shù)確計數(shù) 18 在合適的稀釋度下，每在合適的稀釋度下，每 一個活細胞在固體平板一個活細胞在固體平板 上（內(nèi)）行成一個單菌上（內(nèi)）

12、行成一個單菌 落。實際上一個單菌落落。實際上一個單菌落 可能是多個細胞一起形可能是多個細胞一起形 成，所以在科研中一般成，所以在科研中一般 用菌落形成單位（用菌落形成單位（colony forming units， CFU） 來表示（來表示（CFU/ml），而），而 不是直接表示為細胞數(shù)不是直接表示為細胞數(shù) （cell/ml）。）。 19 當樣品的菌數(shù)很低時，怎么辦？當樣品的菌數(shù)很低時，怎么辦？ 膜過濾培養(yǎng)法膜過濾培養(yǎng)法 當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲 用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基用水等樣品通過膜過濾器

13、，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基 上進行培養(yǎng)，對形成的菌落進行統(tǒng)計。上進行培養(yǎng)，對形成的菌落進行統(tǒng)計。 20 21 （二）間接法（活菌計數(shù)）（二）間接法（活菌計數(shù)） 2. 厭氧菌的菌落計數(shù)厭氧菌的菌落計數(shù) 滾管培養(yǎng)法（見教材滾管培養(yǎng)法（見教材P167 ） 22 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的主要因素 微生物的生長規(guī)律微生物的生長規(guī)律 微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)法概論 微生物的微生物的 新陳代謝新陳代謝 有害微生物的控制有害微生物的控制 微生物的生長及其控制微生物的生長及其控制 23 第二節(jié)第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律微生物的生長規(guī)律 一、微生物的個體生長

14、和同步生長一、微生物的個體生長和同步生長 個體微小個體微小 肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個 單個的微生物組成的群體單個的微生物組成的群體 只能用電子顯微鏡觀察只能用電子顯微鏡觀察 細胞的超薄切片，研究細胞的超薄切片，研究 單個細胞的單個細胞的細胞學變化細胞學變化 利用利用同步培養(yǎng)技術(shù)同步培養(yǎng)技術(shù)（synchronous culture），使某一群體），使某一群體 中的所有個體細胞盡可能都處于同樣細胞生長和分裂周期中的所有個體細胞盡可能都處于同樣細胞生長和分裂周期 中，然后通過分析此群體在各個階段的生物化學特性變化，中，然后通過分析此群體在各個階段的生物

15、化學特性變化， 間接了解單個細胞的間接了解單個細胞的生物化學變化生物化學變化 很難研究其生物化學很難研究其生物化學 變化和細胞學變化變化和細胞學變化 24 同步生長：同步生長：通過同步培養(yǎng)的手段而使細胞群通過同步培養(yǎng)的手段而使細胞群 體中各個體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)體中各個體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài) 獲得微生物同步生長的方法獲得微生物同步生長的方法 環(huán)境條件誘導法環(huán)境條件誘導法 氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成 細菌芽孢誘導發(fā)芽細菌芽孢誘導發(fā)芽 藻類細胞的光照、黑暗控制藻類細胞的光照、黑暗控制 EDTA或離子載體處理酵母菌或離子載體處理酵母菌 短期熱休克法（原生動物）短期熱休克法

16、（原生動物） 機械篩選法機械篩選法利用處于同一生長階段細胞的體積、利用處于同一生長階段細胞的體積、 大小的相同性大小的相同性 過濾法、密度梯度離心法、過濾法、密度梯度離心法、膜洗脫法（膜洗脫法（Helmstetter- Cummings） 25 二、單細胞微生物的典型生長曲線二、單細胞微生物的典型生長曲線 個體微小個體微小 肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個 單個的微生物組成的群體。單個的微生物組成的群體。 微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。 對細菌群體生長規(guī)律的了解是對其進行研

17、究與利用的基礎(chǔ)對細菌群體生長規(guī)律的了解是對其進行研究與利用的基礎(chǔ) 26 生長曲線生長曲線（growth curve）：定量描述液體定量描述液體 培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線 分批式培養(yǎng)（分批式培養(yǎng)（batch culture） 是微生物培養(yǎng)的一種方式。指的是在三角瓶或是微生物培養(yǎng)的一種方式。指的是在三角瓶或 者發(fā)酵罐等培養(yǎng)容器中，放入一定量的培養(yǎng)基，者發(fā)酵罐等培養(yǎng)容器中，放入一定量的培養(yǎng)基， 接種微生物細胞，置于合適的條件下進行培養(yǎng)。接種微生物細胞，置于合適的條件下進行培養(yǎng)。 在整個培養(yǎng)過程中，既沒有新鮮培養(yǎng)基的加入，在整個培養(yǎng)過程中，既沒有新鮮培養(yǎng)

18、基的加入， 也沒用內(nèi)部培養(yǎng)物的移出，最后也沒用內(nèi)部培養(yǎng)物的移出，最后一次性收獲細一次性收獲細 胞或者代謝產(chǎn)物胞或者代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)過程。的培養(yǎng)過程。 27 單細胞微生物的典型生長曲線單細胞微生物的典型生長曲線 將少量純種單細胞微生物接種到定量的液體培養(yǎng)基中進行分將少量純種單細胞微生物接種到定量的液體培養(yǎng)基中進行分 批式培養(yǎng)，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會由小批式培養(yǎng)，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會由小 到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng)到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng) 時間為橫座標，以細胞數(shù)目的對數(shù)值為縱座標作圖，得到的時間為橫座標，以細胞數(shù)

19、目的對數(shù)值為縱座標作圖，得到的 一條由延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期一條由延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 4個階段組成的曲個階段組成的曲 線。線。 28 單細胞微生物的典型生長曲線單細胞微生物的典型生長曲線 將少量純種單細胞微生物接種到定量的液體培養(yǎng)基中進行將少量純種單細胞微生物接種到定量的液體培養(yǎng)基中進行 分批式培養(yǎng)，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會分批式培養(yǎng)，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會 由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。定時取樣測定細胞數(shù)量，由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。定時取樣測定細胞數(shù)量， 以培養(yǎng)時間為橫座標，以細胞數(shù)目的對數(shù)值為縱座標作圖以培養(yǎng)時間為橫座標，以細胞數(shù)目的對

20、數(shù)值為縱座標作圖 ，得到的一條由延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，得到的一條由延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 4個階段個階段 組成的曲線。組成的曲線。 接種、培養(yǎng)、定時取樣接種、培養(yǎng)、定時取樣 稀稀 釋、釋、 涂涂 平平 板、板、 計計 數(shù)、數(shù)、 作作 圖圖 計數(shù)方法：計總菌數(shù)或活菌數(shù)計數(shù)方法：計總菌數(shù)或活菌數(shù) 29 由于采用活菌計數(shù)比較麻煩，由于采用活菌計數(shù)比較麻煩， 并要求嚴格進行操作，否則不易并要求嚴格進行操作，否則不易 得到準確的結(jié)果，重復性也差，得到準確的結(jié)果，重復性也差， 因此在實際工作中多采用分光光因此在實際工作中多采用分光光 度計測定度計測定OD值的方法繪制細菌值的方法繪制細菌

21、 的生長曲線。的生長曲線。 30 根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（每小時的分裂代數(shù)，（每小時的分裂代數(shù)， 表示為表示為R） 的不同，一般把典型的生長曲線分為的不同，一般把典型的生長曲線分為: : 延滯期延滯期（遲緩期），（遲緩期），指數(shù)期指數(shù)期（對數(shù)期），（對數(shù)期），穩(wěn)定期穩(wěn)定期和和 衰亡期衰亡期等等4 4個生長時期個生長時期 延滯期延滯期 指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期 31 延滯期延滯期指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期 （一）（一）延滯期延滯期（lag phase） 將少量單細胞微生物接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時將少量單細胞微生物接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時

22、 間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。 也稱也稱停滯期停滯期、調(diào)整期調(diào)整期或或適應(yīng)期適應(yīng)期。 32 （一）（一）延滯期延滯期（lag phase） 延滯期的特點延滯期的特點：分裂遲緩、代謝活躍分裂遲緩、代謝活躍 生長速率常數(shù)生長速率常數(shù)R為零為零 細胞形態(tài)變大或增長，細胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌長成絲狀，例如巨大芽孢桿菌，在延許多桿菌長成絲狀，例如巨大芽孢桿菌，在延 滯期末，細胞的平均長度比剛接種時長滯期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于延滯期的細菌細倍。一般來說處于延滯期的細菌細 胞體積最大胞體積最大 細胞內(nèi)細胞內(nèi)

23、RNA尤其是尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性 合成代謝活躍，核糖體、合成代謝活躍，核糖體、 酶類和酶類和ATP的合成加速，易產(chǎn)生誘的合成加速，易產(chǎn)生誘 導酶導酶 對外界不良條件反應(yīng)敏感對外界不良條件反應(yīng)敏感 細胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩細胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩 在此階段后期，少數(shù)細胞開始分裂，曲線略有上升。在此階段后期，少數(shù)細胞開始分裂，曲線略有上升。 33 （一）（一）延滯期延滯期（lag phase） 遲緩期出現(xiàn)的原因遲緩期出現(xiàn)的原因 微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏分解或催化有關(guān)微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏分解或催化有關(guān) 底物的酶，或是缺

24、乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘 導酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。導酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。 34 （一）（一）延滯期延滯期（lag phase） 影響延滯期長短的主要因素及在生產(chǎn)實踐中縮短延影響延滯期長短的主要因素及在生產(chǎn)實踐中縮短延 滯期的常用手段滯期的常用手段 （1）菌種（生長快的菌比生長緩慢的菌延滯期短）菌種（生長快的菌比生長緩慢的菌延滯期短） 通過遺傳學方法改變種的遺傳特性使延滯期縮短通過遺傳學方法改變種的遺傳特性使延滯期縮短 （2）接種齡（接種物或種子的生長年齡）接種齡（接種物或種子的生長年齡） 采用對數(shù)生長

25、期的菌作為接種菌可縮短延滯期。采用對數(shù)生長期的菌作為接種菌可縮短延滯期。 （3）接種量）接種量 適當提高接種量可縮短延滯期（種子適當提高接種量可縮短延滯期（種子/發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基=1:10）。）。 （4）培養(yǎng)基成分）培養(yǎng)基成分 營養(yǎng)豐富，與種子培養(yǎng)條件接近的培養(yǎng)基可縮短延滯期。營養(yǎng)豐富，與種子培養(yǎng)條件接近的培養(yǎng)基可縮短延滯期。 （5）種子損傷度）種子損傷度 35 延滯期延滯期指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期 （二）（二）指數(shù)期指數(shù)期（exponential phase） 指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級 數(shù)增長的時期。也稱

26、數(shù)增長的時期。也稱對數(shù)期對數(shù)期（log phase）。）。 36 （二）（二）指數(shù)期指數(shù)期（exponential phase） 指數(shù)期的特點指數(shù)期的特點：代謝旺盛，生長迅速、生理特性一致代謝旺盛，生長迅速、生理特性一致 生長速率常數(shù)生長速率常數(shù)R最大，因而最大，因而代時代時（ generation time，G，又稱，又稱 世代時間或增代時間）或世代時間或增代時間）或倍增時間倍增時間（doubling time）最短）最短 細胞進行平衡生長，故菌體各部分的成分十分均勻細胞進行平衡生長，故菌體各部分的成分十分均勻 酶系活躍，代謝旺盛酶系活躍，代謝旺盛 指數(shù)期尤其是指數(shù)中期的微生物因具有整個群體

27、的生理特指數(shù)期尤其是指數(shù)中期的微生物因具有整個群體的生理特 性較一致、細胞各成分平衡增長和生長速率恒定等優(yōu)點，性較一致、細胞各成分平衡增長和生長速率恒定等優(yōu)點， 所以是代謝、生理和酶學等研究的良好材料，是增殖噬菌所以是代謝、生理和酶學等研究的良好材料，是增殖噬菌 體的最適宿主，也是發(fā)酵工業(yè)中用作種子的最佳材料。體的最適宿主，也是發(fā)酵工業(yè)中用作種子的最佳材料。 指細胞每分裂一次所需的時間指細胞每分裂一次所需的時間 原生質(zhì)增加一倍所需的時間原生質(zhì)增加一倍所需的時間 37 （二）（二）指數(shù)期指數(shù)期（exponential phase） 影響指數(shù)期代時長短的主要因素影響指數(shù)期代時長短的主要因素 （1）

28、菌種）菌種 納米細菌（納米細菌（nanobacteria) 三天才分裂一次；三天才分裂一次； 九十年代初期從地下數(shù)公九十年代初期從地下數(shù)公 里發(fā)現(xiàn)的超微型細菌，用里發(fā)現(xiàn)的超微型細菌，用 代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)生的CO2作指標，計作指標，計 算出這些超微菌的代謝速算出這些超微菌的代謝速 率僅為地上正常細菌的率僅為地上正常細菌的10- 15，有人認為它們需要 ，有人認為它們需要100 年才能分裂一次。年才能分裂一次。 38 （二）（二）指數(shù)期指數(shù)期（exponential phase） 影響指數(shù)期代時長短的主要因素影響指數(shù)期代時長短的主要因素 （1）菌種）菌種 （2）營養(yǎng)成分（營養(yǎng)豐富，代時短）營養(yǎng)成分

29、（營養(yǎng)豐富，代時短） （3）營養(yǎng)物濃度）營養(yǎng)物濃度 （4）培養(yǎng)溫度（在一定范圍內(nèi)，生長速率與培養(yǎng)溫度成）培養(yǎng)溫度（在一定范圍內(nèi)，生長速率與培養(yǎng)溫度成 正比，教材正比，教材P155表表6-1） 凡是處于較低濃度范圍內(nèi)可影凡是處于較低濃度范圍內(nèi)可影 響生長速率和菌體產(chǎn)量的某營響生長速率和菌體產(chǎn)量的某營 養(yǎng)物，就稱為養(yǎng)物，就稱為生長限制因子生長限制因子 （growth-limted factor）。）。 39 延滯期延滯期 指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期 （三）（三）穩(wěn)定期穩(wěn)定期（stationary phase） 穩(wěn)定期又稱恒定期或最高生產(chǎn)期穩(wěn)定期又稱恒定期或最高生產(chǎn)期 40 （三）（三）穩(wěn)

30、定期穩(wěn)定期（ stationary phase ） 穩(wěn)定期的特點穩(wěn)定期的特點 生長速率常數(shù)生長速率常數(shù)R等于零，即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡等于零，即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡 的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中 菌體產(chǎn)量達到最高菌體產(chǎn)量達到最高 細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段：積聚糖原等細胞內(nèi)含物；形細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段：積聚糖原等細胞內(nèi)含物；形 成芽孢；合成成芽孢；合成次生代謝物次生代謝物。 是收獲菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物的最佳時期是收獲菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物的最佳時期 是對維生素、堿基、氨基酸等物質(zhì)進行生物測定的最佳時

31、期是對維生素、堿基、氨基酸等物質(zhì)進行生物測定的最佳時期 研究穩(wěn)定期到來的原因促進連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝的創(chuàng)建研究穩(wěn)定期到來的原因促進連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝的創(chuàng)建 因在穩(wěn)定期形成，因在穩(wěn)定期形成， 又稱穩(wěn)定期產(chǎn)物又稱穩(wěn)定期產(chǎn)物 41 穩(wěn)定期到來的原因穩(wěn)定期到來的原因 （1）營養(yǎng)物尤其是生長因子的耗盡）營養(yǎng)物尤其是生長因子的耗盡 （2）營養(yǎng)物比例失調(diào)）營養(yǎng)物比例失調(diào) （3）有害代謝產(chǎn)物（酸、醇、毒素、）有害代謝產(chǎn)物（酸、醇、毒素、H2O2等）的積累等）的積累 （4）pH、氧化還原電勢等物理化學條件越來越不適宜、氧化還原電勢等物理化學條件越來越不適宜 （三）（三）穩(wěn)定期穩(wěn)定期（ stationa

32、ry phase ） 生產(chǎn)上延長穩(wěn)定期的措施生產(chǎn)上延長穩(wěn)定期的措施 補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料） 取走代謝產(chǎn)物取走代謝產(chǎn)物 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH、溫度、對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩、溫度、對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩 42 延滯期延滯期 指數(shù)期指數(shù)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期衰亡期衰亡期 （四）（四）衰亡期衰亡期（decline phase） 整個群體生長速率整個群體生長速率R為負值的時期為負值的時期 43 （四）（四）衰亡期衰亡期（decline phase ） 衰亡期的特點衰亡期的特點 個體死亡速度超過新生速度，個體死亡速度超過新生速度，R為負值為負值 細胞形態(tài)發(fā)生多形化細胞形態(tài)發(fā)生多形化 細胞開始

33、自溶細胞開始自溶 進一步合成或釋放次生代謝物進一步合成或釋放次生代謝物 芽孢桿菌釋放芽孢芽孢桿菌釋放芽孢 產(chǎn)生衰亡期的主要原因產(chǎn)生衰亡期的主要原因 環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，分解代謝明顯超過合成代謝環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，分解代謝明顯超過合成代謝 44 三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)三、微生物的連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture）：又稱）：又稱開放培養(yǎng)開放培養(yǎng)(open culture)，是指向培養(yǎng)容器中，是指向培養(yǎng)容器中連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)液連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)液，使微生，使微生 物的液體培養(yǎng)物長期維持穩(wěn)定、高速生長狀態(tài)的一種溢流培物的液體培養(yǎng)物長期維持穩(wěn)定、高速生長狀態(tài)的一種

34、溢流培 養(yǎng)技術(shù)。養(yǎng)技術(shù)。 典型生長曲線反映的是典型生長曲線反映的是分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)（batch culture）或）或密閉密閉 培養(yǎng)培養(yǎng)（closed culture）時的生長規(guī)律：）時的生長規(guī)律： 培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換，導致培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換，導致穩(wěn)定期穩(wěn)定期和和衰亡衰亡 期期的出現(xiàn)的出現(xiàn) 我們的期望：長時間保持微生物的我們的期望：長時間保持微生物的對數(shù)生長狀態(tài)對數(shù)生長狀態(tài)以提高經(jīng)濟以提高經(jīng)濟 效益效益 45 三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)三、微生物的連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)的原則連續(xù)培養(yǎng)的原則 當微生物以分批式培養(yǎng)到當微生物以分批式培養(yǎng)到指數(shù)期后期指數(shù)期后期時時： 以一定

35、速度連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基和通入無菌空氣（厭氧菌以一定速度連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基和通入無菌空氣（厭氧菌 例外）例外） 采用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物采用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物 目的是使容器內(nèi)的培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物可目的是使容器內(nèi)的培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物可 長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和恒定的生長速率上，形長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和恒定的生長速率上，形 成成連續(xù)生長（連續(xù)生長（continuous growth） 46 三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)三、微生物的連續(xù)培養(yǎng) （一）連續(xù)培養(yǎng)的類型（一）連續(xù)培養(yǎng)的類型 按控制按控制 方式分方式分 恒濁連續(xù)培養(yǎng)：內(nèi)

36、控制（控制菌體密度）恒濁連續(xù)培養(yǎng)：內(nèi)控制（控制菌體密度） 恒化連續(xù)培養(yǎng)：外控制（控制培養(yǎng)液流速及恒化連續(xù)培養(yǎng)：外控制（控制培養(yǎng)液流速及R） 按培養(yǎng)按培養(yǎng) 器串聯(lián)器串聯(lián) 級數(shù)分級數(shù)分 單級連續(xù)培養(yǎng)單級連續(xù)培養(yǎng) 多級連續(xù)培養(yǎng)多級連續(xù)培養(yǎng) 47 測定所培養(yǎng)微生物的光密度值測定所培養(yǎng)微生物的光密度值 自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速 使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度 當濁度超過預期數(shù)值時，培養(yǎng)液流速加快，使?jié)岫冉档?；當濁度超過預期數(shù)值時，培養(yǎng)液流速加快，使?jié)岫冉档停?當濁度低于預期數(shù)值時，培養(yǎng)液流速減慢，使?jié)岫壬撸划敐岫?/p>

37、低于預期數(shù)值時，培養(yǎng)液流速減慢，使?jié)岫壬撸?恒濁培養(yǎng)器的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定的恒濁培養(yǎng)器的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定的 （1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)）恒濁連續(xù)培養(yǎng) 48 （1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)）恒濁連續(xù)培養(yǎng) 使微生物維持最高的生長速率使微生物維持最高的生長速率 生產(chǎn)實踐上，一般用于為了獲得大量菌體以及與生產(chǎn)實踐上，一般用于為了獲得大量菌體以及與 菌體生長平行的某些代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工業(yè)菌體生長平行的某些代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工業(yè) 連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵 49 （2）恒化連續(xù)培養(yǎng)）恒化連續(xù)培養(yǎng) 使培養(yǎng)液流速保持不變，并使使培養(yǎng)液流速保持不變，并使 微生物始終在低于其最高生長微生物始終在低于其最高

38、生長 速率的條件下進行生長繁殖速率的條件下進行生長繁殖 50 恒化連續(xù)培養(yǎng)中，通過控制某一營養(yǎng)物的濃度，使其恒化連續(xù)培養(yǎng)中，通過控制某一營養(yǎng)物的濃度，使其 始終成為生長限制因子，而其他營養(yǎng)物均過量始終成為生長限制因子，而其他營養(yǎng)物均過量 （2）恒化連續(xù)培養(yǎng)）恒化連續(xù)培養(yǎng) 恒化器中微生物生長與稀釋率的關(guān)系恒化器中微生物生長與稀釋率的關(guān)系 微生物的生長速率取決于限制性因子的濃度，并低于最高生長速率微生物的生長速率取決于限制性因子的濃度，并低于最高生長速率 恒化器中，營養(yǎng)物的更新速度以恒化器中，營養(yǎng)物的更新速度以 稀釋率（稀釋率（dilution rate, D）表示）表示 D = 流速（流速（ml

39、/h） 培養(yǎng)器容積（培養(yǎng)器容積（ml） 遺傳學：突變株分離；遺傳學：突變株分離； 生理學：不同條件下的代謝變化；生理學：不同條件下的代謝變化； 生態(tài)學：模擬自然營養(yǎng)條件建立實驗?zāi)Ｐ停簧鷳B(tài)學：模擬自然營養(yǎng)條件建立實驗?zāi)Ｐ停?多用于科研，尤其是與生長速率相關(guān)的理論研究多用于科研，尤其是與生長速率相關(guān)的理論研究 51 單級連續(xù)培養(yǎng)單級連續(xù)培養(yǎng) 多級連續(xù)培養(yǎng)多級連續(xù)培養(yǎng) 微生物的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速率微生物的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速率 與菌體生長速率相平行與菌體生長速率相平行 生產(chǎn)的產(chǎn)物與菌體生長不平行生產(chǎn)的產(chǎn)物與菌體生長不平行 詳見詳見P158 （二）連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點（二）連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點 連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點（詳

40、見連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點（詳見P159） 優(yōu)點優(yōu)點：高效節(jié)約，自控，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定：高效節(jié)約，自控，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 缺點缺點：菌種易退化，易污染，營養(yǎng)物利用率低：菌種易退化，易污染，營養(yǎng)物利用率低 52 四、微生物的高密度培養(yǎng)四、微生物的高密度培養(yǎng) 自學自學P159-160 53 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的主要因素 微生物的生長規(guī)律微生物的生長規(guī)律 微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)法概論 微生物的微生物的 新陳代謝新陳代謝 有害微生物的控制有害微生物的控制 微生物的生長及其控制微生物的生長及其控制 54 第三節(jié)第三節(jié) 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的

41、主要因素 影響微生物生長的外界因素很多，最主要的物影響微生物生長的外界因素很多，最主要的物 理因素有理因素有3個：個：溫度溫度、氧氣氧氣和和pH值。值。 55 一、溫度一、溫度 1. 微生物生長的三個溫度常數(shù)微生物生長的三個溫度常數(shù)生長溫度三基點生長溫度三基點 最適生長溫度最適生長溫度（optimum temperature） 最高生長溫度最高生長溫度（maximum temperature） 最低生長溫度最低生長溫度（minimum temperature） 簡稱為簡稱為“最適溫度最適溫度”，指某菌分裂代時最短或生長速率，指某菌分裂代時最短或生長速率 最高時的培養(yǎng)溫度最高時的培養(yǎng)溫度 同一種

42、微生物的最適生長溫度并非是其一切生理過程的最適溫度同一種微生物的最適生長溫度并非是其一切生理過程的最適溫度 56 最低生長溫度最低生長溫度：在此溫度：在此溫度 下，生長不會發(fā)生。細胞下，生長不會發(fā)生。細胞 膜凝固，影響營養(yǎng)物質(zhì)的膜凝固，影響營養(yǎng)物質(zhì)的 運輸和質(zhì)子動力的形成。運輸和質(zhì)子動力的形成。 最高生長溫度最高生長溫度：蛋白質(zhì)變：蛋白質(zhì)變 性，細胞膜破裂性，細胞膜破裂 最適生長溫度最適生長溫度：酶活性最：酶活性最 大，細胞生長速率最高大，細胞生長速率最高 57 根據(jù)微生物的最適溫度可將它們劃分為根據(jù)微生物的最適溫度可將它們劃分為4大群：大群： （1）嗜冷菌（）嗜冷菌（psychrophile

43、s） Topt15 永久寒冷的地區(qū)。永久寒冷的地區(qū)。 （2）嗜溫菌（）嗜溫菌（mesophiles） Topt 45 溫血動物，熱帶與溫帶土壤、水域。溫血動物，熱帶與溫帶土壤、水域。 （3）嗜熱菌（）嗜熱菌（thermophiles） Topt 45 很熱的環(huán)境中：堆肥。很熱的環(huán)境中：堆肥。 （4）超嗜熱菌（）超嗜熱菌（hyperthermophiles） Topt80 極端熱的環(huán)境：火山口，硫磺熱泉，自燃煤堆極端熱的環(huán)境：火山口，硫磺熱泉，自燃煤堆 2. 微生物生長的溫度范圍微生物生長的溫度范圍 58 Growth rate 微生物可生長溫度范圍的廣泛性（微生物可生長溫度范圍的廣泛性（P16

44、0，表，表6-4） 59 二、氧氣二、氧氣 好氧菌好氧菌 (aerobes) 微微 生生 物物 與與 氧氧 的的 關(guān)關(guān) 系系 厭氧菌厭氧菌 (anaerobes) 專性好氧菌專性好氧菌（obligate or strict aerobes） 呼吸產(chǎn)能。需氧，必須在較高濃度（呼吸產(chǎn)能。需氧，必須在較高濃度（20.2 kPa） 分子氧的條件下才能生長分子氧的條件下才能生長 兼性厭氧菌兼性厭氧菌（facultative anaerobes） 呼吸產(chǎn)能為主，兼營發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能。在以呼吸產(chǎn)能為主，兼營發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能。在以 有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧

45、條件下生長 微好氧菌微好氧菌（microaerobes） 呼吸產(chǎn)能。較低的氧分壓呼吸產(chǎn)能。較低的氧分壓 (1.01-3.04 kPa) 下生長下生長 耐氧菌耐氧菌（aerotolerant anaerobes） 發(fā)酵產(chǎn)能，不需氧，但氧無毒害作用發(fā)酵產(chǎn)能，不需氧，但氧無毒害作用 專性厭氧菌專性厭氧菌（obligate anaerobes） 發(fā)酵、無氧呼吸或循環(huán)光合磷酸化產(chǎn)能。氧對其發(fā)酵、無氧呼吸或循環(huán)光合磷酸化產(chǎn)能。氧對其 有毒害或者致死效應(yīng)有毒害或者致死效應(yīng) 60 微生物與氧的關(guān)系微生物與氧的關(guān)系 61 二、氧氣二、氧氣 氧對微生物的毒害機制氧對微生物的毒害機制 J. M. McCord和和I

46、. Fridovich的超氧化物歧化酶的超氧化物歧化酶 （SOD）學說：）學說： 嚴格厭氧菌無嚴格厭氧菌無SOD活力，一般也無過氧化氫酶活力活力，一般也無過氧化氫酶活力 所有具細胞色素系統(tǒng)的好氧菌都有所有具細胞色素系統(tǒng)的好氧菌都有SOD和過氧化氫酶和過氧化氫酶 耐氧性厭氧菌不含細胞色素系統(tǒng)，具有耐氧性厭氧菌不含細胞色素系統(tǒng)，具有SOD活力無過活力無過 氧化氫酶活力氧化氫酶活力 SOD的功能是保護好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的功能是保護好氧菌免受超氧化物陰離子自由基 的毒害，缺乏的毒害，缺乏SOD的微生物只能進行專性厭氧生活。的微生物只能進行專性厭氧生活。 62 二、氧氣二、氧氣 氧對微生物的

47、毒害機制氧對微生物的毒害機制 氧在生物體內(nèi)可由酶促方式或非酶促方式形成超氧陰離子自氧在生物體內(nèi)可由酶促方式或非酶促方式形成超氧陰離子自 由基（由基（O2-）。）。O2-是活性氧的形式之一，帶負電，既有分子性是活性氧的形式之一，帶負電，既有分子性 質(zhì)，又有離子性質(zhì)，性質(zhì)極不穩(wěn)定，化學反應(yīng)力極強，在細質(zhì)，又有離子性質(zhì)，性質(zhì)極不穩(wěn)定，化學反應(yīng)力極強，在細 胞內(nèi)可破壞各種生物大分子和膜結(jié)構(gòu)，還可形成其他活性氧胞內(nèi)可破壞各種生物大分子和膜結(jié)構(gòu)，還可形成其他活性氧 化物，對生物體造成毒害?；铮瑢ι矬w造成毒害。 專性厭氧微生物缺乏超氧化物歧化酶專性厭氧微生物缺乏超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶，所和過氧

48、化氫酶，所 以不能使以不能使O2-歧化成歧化成H2O2，因而細胞會受到，因而細胞會受到O2-毒害。毒害。 O2- + 2H+ SOD H2O2 + O2 過氧化氫酶過氧化氫酶 過氧化物酶過氧化物酶 NADH2 NAD+ H2O+1/2O2 2 H2O （好氧及耐氧菌）（好氧及耐氧菌） （好氧菌）（好氧菌） （耐氧菌）（耐氧菌） 63 三、三、pH 某一個微生物的生長某一個微生物的生長pH存在存在“三基點三基點”（P164） 微生物作為一個整體，生長的微生物作為一個整體，生長的pH范圍極廣范圍極廣 大多數(shù)微生物的生長大多數(shù)微生物的生長pH都在都在5 9之間之間 只有少數(shù)生物能在低于只有少數(shù)生物能

49、在低于2或高于或高于10的的pH中生長中生長 64 三、三、pH 嗜酸性嗜酸性 （pH 0 5.5） 嗜中性嗜中性 （pH 5.5 8.0） 嗜堿性嗜堿性 （pH 8.0） 65 三、三、pH pH對微生物生長的影響對微生物生長的影響 同一種微生物在不同生長階段和不同的生理、生化過程同一種微生物在不同生長階段和不同的生理、生化過程 中，具有不同的最適中，具有不同的最適pH。如黑曲霉：。如黑曲霉：pH=2.02.5，利，利 于合成檸檬酸；于合成檸檬酸；pH=2.56.5 ，以菌體生長為主；，以菌體生長為主；pH=7 左右，大量合成草酸左右，大量合成草酸 微生物外環(huán)境的微生物外環(huán)境的pH變化較大，

50、但細胞內(nèi)變化較大，但細胞內(nèi)pH相對穩(wěn)定，相對穩(wěn)定， 接近中性，有利用保護生物大分子以及細胞器的功能接近中性，有利用保護生物大分子以及細胞器的功能 pH影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微 生物對其的吸收生物對其的吸收 pH影響代謝反應(yīng)中各種酶的活性影響代謝反應(yīng)中各種酶的活性 pH影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性 66 三、三、pH 微生物的生命活動會改變外界環(huán)境的微生物的生命活動會改變外界環(huán)境的pH pH的變化與培養(yǎng)基的組分尤其是碳氮比有很大關(guān)系：的變化與培養(yǎng)基的組分尤其是碳氮比有很大關(guān)系： 碳氮比高（如真菌培

51、養(yǎng)基）：碳氮比高（如真菌培養(yǎng)基）：pH下降下降 碳氮比低（如細菌培養(yǎng)基）：碳氮比低（如細菌培養(yǎng)基）：pH上升上升 微生物培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)中調(diào)節(jié)微生物培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)中調(diào)節(jié)pH的措施的措施 “治標治標”：用酸性溶液或堿性溶液調(diào)節(jié)：用酸性溶液或堿性溶液調(diào)節(jié) “治本治本”：添加碳源：添加碳源/氮源，調(diào)節(jié)改變通氣量氮源，調(diào)節(jié)改變通氣量 67 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的主要因素 微生物的生長規(guī)律微生物的生長規(guī)律 微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)法概論 微生物的微生物的 新陳代謝新陳代謝 有害微生物的控制有害微生物的控制 微生物的生長及其控制微生物的生長及其控制

52、68 第四節(jié)第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)法概論 良好的微生物培養(yǎng)裝置的基本條件良好的微生物培養(yǎng)裝置的基本條件 按照微生物的生長規(guī)律進行科學的設(shè)計按照微生物的生長規(guī)律進行科學的設(shè)計 能在提供豐富而均勻的營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，保證微生能在提供豐富而均勻的營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，保證微生 物獲得適宜的溫度和良好的通氣條件（厭氧菌例外）物獲得適宜的溫度和良好的通氣條件（厭氧菌例外） 為微生物提供一個適宜的物理化學條件為微生物提供一個適宜的物理化學條件 嚴防雜菌的污染嚴防雜菌的污染 目的：目的：保證微生物大量生長繁殖以產(chǎn)生菌體和有益代謝產(chǎn)物保證微生物大量生長繁殖以產(chǎn)生菌體和有益代謝產(chǎn)物 69 一、實驗室培養(yǎng)

53、法一、實驗室培養(yǎng)法 （一）固體培養(yǎng)（一）固體培養(yǎng) 1、好氧菌的固體培養(yǎng)、好氧菌的固體培養(yǎng) 試管斜面，培養(yǎng)皿瓊脂平板，克氏扁瓶，茄子瓶試管斜面，培養(yǎng)皿瓊脂平板，克氏扁瓶，茄子瓶 70 （一）固體培養(yǎng)（一）固體培養(yǎng) 2、厭氧菌的固體培養(yǎng)、厭氧菌的固體培養(yǎng) 厭氧菌培養(yǎng)除需要厭氧菌培養(yǎng)除需要特殊的培養(yǎng)裝置或器皿特殊的培養(yǎng)裝置或器皿外，首先外，首先 應(yīng)配置應(yīng)配置特殊培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中得加合適的，培養(yǎng)基中得加合適的還原劑還原劑 （1）高層瓊脂柱）高層瓊脂柱 （4）厭氧罐）厭氧罐 （2）厭氧培養(yǎng)皿）厭氧培養(yǎng)皿 （5）厭氧手套箱）厭氧手套箱 （3）亨蓋特滾管技術(shù)）亨蓋特滾管技術(shù) 71 Brewer 皿

54、皿 Spray皿皿 厭氧培養(yǎng)皿厭氧培養(yǎng)皿 特制皿蓋特制皿蓋 特制皿底特制皿底 72 亨蓋特滾管技術(shù)亨蓋特滾管技術(shù) 用途：用途：用于研究嚴格厭氧菌的技術(shù)用于研究嚴格厭氧菌的技術(shù) 和裝置和裝置 特點：特點：集制備高純氮、以氮驅(qū)氧和集制備高純氮、以氮驅(qū)氧和 全過程實現(xiàn)無氧操作、無氧全過程實現(xiàn)無氧操作、無氧 培養(yǎng)、無氧檢測于一體培養(yǎng)、無氧檢測于一體 用于用于Hungate 滾管技術(shù)中滾管技術(shù)中 的厭氧試管剖面圖的厭氧試管剖面圖 主要原理：利用除氧銅柱在主要原理：利用除氧銅柱在350下與氧反應(yīng)下與氧反應(yīng) 來制備高純度氮，再用此高純度氮去驅(qū)除培養(yǎng)來制備高純度氮，再用此高純度氮去驅(qū)除培養(yǎng) 基配制、分裝過程中

55、各種容器和小環(huán)境中的空基配制、分裝過程中各種容器和小環(huán)境中的空 氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以 及接種、稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保及接種、稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保 藏等操作的全過程始終處于高度無氧的環(huán)境下，藏等操作的全過程始終處于高度無氧的環(huán)境下， 從而保證了嚴格厭氧菌的存活。從而保證了嚴格厭氧菌的存活。 73 厭氧罐厭氧罐 催化劑室催化劑室 內(nèi)含鈀粒內(nèi)含鈀粒 產(chǎn)氣袋產(chǎn)氣袋 加水能產(chǎn)生加水能產(chǎn)生 CO2和和H2 厭氧指示劑厭氧指示劑 無氧時美藍無氧時美藍 變無色變無色 74 厭氧手套箱厭氧手套箱 交換室交換室 外界物件外界物件 進

56、出箱體進出箱體 接種室和培養(yǎng)室接種室和培養(yǎng)室 結(jié)構(gòu)嚴密不透氣，充結(jié)構(gòu)嚴密不透氣，充 滿惰性氣體，并有鈀滿惰性氣體，并有鈀 催化劑保證箱內(nèi)處于催化劑保證箱內(nèi)處于 高度無氧狀態(tài)高度無氧狀態(tài) 用于無氧操作和培養(yǎng)嚴格厭氧菌用于無氧操作和培養(yǎng)嚴格厭氧菌 75 一、實驗室培養(yǎng)法一、實驗室培養(yǎng)法 （二）液體培養(yǎng)（二）液體培養(yǎng) 1、好氧菌的液體培養(yǎng)、好氧菌的液體培養(yǎng) 在液體培養(yǎng)中，氧的供應(yīng)始終是好氧菌生長繁殖在液體培養(yǎng)中，氧的供應(yīng)始終是好氧菌生長繁殖 的限制因子。提高溶液中氧濃度的措施有：的限制因子。提高溶液中氧濃度的措施有： （1）淺層液體靜止培養(yǎng)）淺層液體靜止培養(yǎng) （2）搖瓶培養(yǎng)）搖瓶培養(yǎng) （3）深層液體

57、底部通氣）深層液體底部通氣 （4）對培養(yǎng)液進行機械攪拌）對培養(yǎng)液進行機械攪拌 76 2、好氧菌液體培養(yǎng)法、好氧菌液體培養(yǎng)法 （1）試管液體培養(yǎng)）試管液體培養(yǎng) （2）三角瓶淺層液體培養(yǎng)）三角瓶淺層液體培養(yǎng) （3）搖瓶培養(yǎng)）搖瓶培養(yǎng) （4）臺式發(fā)酵罐）臺式發(fā)酵罐 3、厭氧菌的液體培養(yǎng)法、厭氧菌的液體培養(yǎng)法 （1）將培養(yǎng)物放入?yún)捬豕藁騾捬跏痔紫渲校⑴囵B(yǎng)物放入?yún)捬豕藁騾捬跏痔紫渲?（2）單獨在有氧環(huán)境下培養(yǎng)：）單獨在有氧環(huán)境下培養(yǎng)： 在培養(yǎng)液中加入巰基乙醇，半胱氨酸，在培養(yǎng)液中加入巰基乙醇，半胱氨酸，VC，皰肉等，皰肉等有機有機 還原劑還原劑，或鐵絲等，或鐵絲等無機還原劑無機還原劑 深層培養(yǎng)或在液面

58、深層培養(yǎng)或在液面封上石蠟油封上石蠟油、凡士林、凡士林-石蠟油石蠟油 （二）液體培養(yǎng)（二）液體培養(yǎng) 77 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的主要因素 微生物的生長規(guī)律微生物的生長規(guī)律 微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)法概論 微生物的微生物的 新陳代謝新陳代謝 有害微生物的控制有害微生物的控制 微生物的生長及其控制微生物的生長及其控制 78 第五節(jié)第五節(jié) 有害微生物的控制有害微生物的控制 控制有害微生物的措施控制有害微生物的措施 殺滅法殺滅法抑制法抑制法 滅滅 菌菌 （徹底殺滅）（徹底殺滅） 消消 毒毒 （部分殺滅，僅（部分殺滅，僅 殺滅病原體）殺滅病原體）

59、化化 療療 （抑制宿主體（抑制宿主體 內(nèi)的病原菌）內(nèi)的病原菌） 防防 腐腐 （抑制霉腐（抑制霉腐 微生物）微生物） 殺殺 菌菌溶溶 菌菌 79 抑制抑制(Inhibition)：生長停止，但不死亡；：生長停止，但不死亡； 防腐防腐(Antisepsis)：完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，即通過抑菌作：完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，即通過抑菌作 用防止食品、生物制品等對象發(fā)生霉腐的措施用防止食品、生物制品等對象發(fā)生霉腐的措施 化療化療(Chemotherapy)：利用具有高度選擇毒力的化學物質(zhì)來抑制宿：利用具有高度選擇毒力的化學物質(zhì)來抑制宿 主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該宿主傳染病的措

60、施主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該宿主傳染病的措施 消毒消毒(Disinfection)：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi) 部一部分對人體或動、植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本部一部分對人體或動、植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本 無害的措施無害的措施 滅菌滅菌(Sterilization)：采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切：采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切 微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施 一、幾個基本概念一、幾個基本概念 死亡死亡(Death)：生長能力不可逆喪失；：生