qPCR實(shí)驗(yàn)操作流程

1、Q-PCR 實(shí) 驗(yàn) 流 程一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開(kāi)15-20分鐘。超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄 膜手套，RNA抽提需帶口罩。取EP管/槍頭時(shí)需用鑷子，不可以 用使用過(guò)的手套直接取用。取完 EP管/槍頭后，袋子及時(shí)封好。橡 膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不得帶出超凈臺(tái)，移 液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺(tái)面。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒(méi)有帶口罩不 要在超凈臺(tái)前講話。二、總RNA抽提1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈， 加入 1ml Trizol （

2、 Invitrogen）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNase free EP管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置 5min；組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混勻， 室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱(chēng)）2）加入200卩氯仿，劇烈振蕩混勻30s,使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫 靜置3-5min:（離心時(shí)離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序 也按順序排好，與第一步的順序一致）3）4C下，14,000g離心15min，可見(jiàn)分為三層，RNA在上層水相，移 至另一個(gè)新的 RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上

3、清，吸上清 時(shí)，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）4）沉淀RNA :加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒 6-8次）（不 應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min；5）4C下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀（如離心后仍不見(jiàn) EP管 底部有沉淀，應(yīng)將 EP管放置在-80度冰箱過(guò)夜，繼續(xù)在 4C下，14,000g 離心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛 倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺(tái)風(fēng)干：沉淀不 能過(guò)干或過(guò)濕，過(guò)干則不易溶解，過(guò)濕則乙醇?xì)埩簟?）視沉淀量加入適量DE

4、PC水（至少15ul）溶解沉淀三、去基因組使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下體系配置反應(yīng)液，37C 消化 30min, 65C 滅活 10min。RNA30plDNase ?20pl10 x buffer10plH2O(RNase free)39.5plRNasi n0.5pl總體積100pl然后按以下步驟操作：1）加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5min，后14,000rpm, 離心15mi n,取上清。2）加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm,離心15min， 取上清。3） 加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8

5、次） , -20C靜置15min;4）4C下，14,000g離心15min，收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min），超凈臺(tái)風(fēng)干；6）加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、總RNA純度和完整性檢測(cè)1）純度檢測(cè)：取1卩l(xiāng) RNA樣品50倍稀釋?zhuān)诤怂岬鞍讬z測(cè)儀上測(cè)定 OD值， OD260/OD280的比值大于1.8，說(shuō)明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。2）總RNA完整性檢測(cè)：取RNA樣品1門(mén)1 %瓊脂糖凝膠電泳80VX20min, EB染色10min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總 RNA的5s rRNA ,18s rRNA和28s rRNA條帶，三

6、條條帶完整的話即可證明總 RNA抽提比較完整。五、逆轉(zhuǎn)錄1. mRNA :1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNA1.0pgH2Opl2）將上述溶液吹 總體積12 卩1打均勻，置85C保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷，以防止RNA復(fù)性；3）在該P(yáng)CR管中加入下列試劑（Promegaoligo (dT)0.5卩1Ran dom primer0.5卩110mM dNTP2.0卩1RNase in hibitor0.5卩15 x buffer4.0卩1M-MLV0.5卩1總體積8.0卩14）將上述20卩反應(yīng)溶液30C保溫10min;5）42 T 保溫 50m

7、in；6）85 T 保溫 10min；7）-20 C 保存。2. microRNA :使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖：1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液2）將上述溶85 C孵打開(kāi)total RNAX個(gè)miR逆轉(zhuǎn)錄引物H2O1.00.5*Xpg卩1液混勻，育5min，以RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。隨后總體積12.5pi立即置于冰上，以防止RNA復(fù)性再次恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:10mM dNTP (promega)2.0plRNase in hibitor (promega)0.5plU6逆轉(zhuǎn)錄引物0.5pl5x buffer4.0plM-MLV (promega)

8、0.5pl總體積7.5pl4） 將3）溶液加入到1）溶液中，混勻后30C保溫10min；5）42C 孵育 50min;6）85C孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。四、定量PCR檢測(cè)1引物測(cè)試：根據(jù)mRNA設(shè)計(jì)的引物正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行qPCR測(cè)試其特異性和擴(kuò)增效率， 具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如正式實(shí)驗(yàn)，每對(duì)引物需做模板水對(duì)照。得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性， 選擇標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)畏迩曳逍?偏窄、水對(duì)照無(wú)明顯引物二聚體熔解曲線峰。 若設(shè)計(jì)的多對(duì)引物熔解曲線均顯示 特異性良好，則應(yīng)對(duì)比各引物的擴(kuò)增曲線，優(yōu)先選擇Ct值小、擴(kuò)增效率高的引物進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。2 確定上機(jī)內(nèi)容后，首先在記錄本上編排好上機(jī)的樣品排放

9、順序。（1） 一個(gè)樣品的加樣盡可能安排在同一行（2）如正式實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)不能安排在同一板上， 則需把三次重復(fù)中的實(shí)驗(yàn)分開(kāi)，但同一次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)不能分開(kāi)兩板3 正式實(shí)驗(yàn)：體系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul（TOYOBO）（使用前需振蕩均勻）上游引物0.5ul（10uM）下游引物0.5ul（10uM）總體積15ul計(jì)算好實(shí)驗(yàn)中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會(huì)有損失，一 般多配0.5份-1份體系?？偟捏w系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻，然后15ul每管分裝至8連管中。3. cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛?，一般?1:20稀釋?zhuān)缬龅交?/p>

10、因表達(dá)低的 樣品，則適當(dāng)降低稀釋比例至1:10或1:5。cDNA按一定順序排好后，即可加至 剛配好的反應(yīng)體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標(biāo) 記好1-12的順序（不可將標(biāo)記寫(xiě)在反應(yīng)管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域， 且保證每孔均蓋緊， 否則影響重復(fù)性或可能出現(xiàn)熔解曲 線峰漂移。）4把各排八連管放在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒。五上機(jī)：5.1 先開(kāi)電腦，進(jìn)入 Windows 界面。接著打開(kāi) PCR 儀電源開(kāi)關(guān)。5.2打開(kāi)7500軟件，選擇“新建”，在“ Template”下拉菜單中選擇“ 60”或 “ 65”（普通基因檢測(cè)為“ 60”， MicroRNA 檢測(cè)為“ 65”）5.3 打開(kāi)樣品架，放入八連管，關(guān)上樣品架，并在軟件上選擇已放反應(yīng)管的孔 位，剔除無(wú)反應(yīng)管的孔位。5.4點(diǎn)擊File菜單中Save,輸入要保存結(jié)果的文件名，命名為日期-上機(jī)時(shí)間- 客戶名字簡(jiǎn)寫(xiě)，如100830-1008-WL表示8月30日10點(diǎn)08分魏立的實(shí)驗(yàn)。5.5點(diǎn)擊Start鍵，開(kāi)始運(yùn)行程序。5.6 程序運(yùn)行完畢后，取出