基因重組方法=全

1、3、基因重組 基因重組（gene recombinationgene recombination）是兩個(gè)獨(dú)立基因組內(nèi) 的遺傳基因，通過交換與重新組合形成新的穩(wěn)定基因組 的過程。 原核微生物基因組 通常只是部分遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和重 組，并且通過轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式進(jìn)行； 真核微生物的基因重組 發(fā)生在有性繁殖過程中，通過 減數(shù)分裂后整套染色體發(fā)生高頻率交換（基因重組） 在真核微生物中的部分真菌存在不通過減數(shù)分裂而在有 絲分裂過程產(chǎn)生低頻率基因重組的準(zhǔn)性生殖方式 細(xì)菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式 接合 轉(zhuǎn)導(dǎo) 自然轉(zhuǎn)化 3.13.1 原核生物的基因重組 接合 (conjugation)(conjugatio

2、n)： 細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F F因子介導(dǎo)） 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(transduction)： 由噬菌體介導(dǎo) 自然遺傳轉(zhuǎn)化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)： 游離DNADNA分子 + + 感受態(tài)細(xì)胞 3.1.1細(xì)菌的接合作用(conjugation) 通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的 遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程 (1).實(shí)驗(yàn)證據(jù) 1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 細(xì)菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn) （參見 P 215） 中間平板上長出的原養(yǎng)型菌

3、落 是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換 和重組所致！ 證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的 “U”型管實(shí)驗(yàn)（ Bernard Davis，1950 ） (2) (2) 機(jī)制 ( (大腸桿菌的接合機(jī)制) ) 接合作用是由一種被稱為F F因子的質(zhì)粒介導(dǎo) F F因子的分子量通常為5 510107 7，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛 （sex pilisex pili）及控制接合過程進(jìn)行的2020多個(gè)基因。 含有F F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F F+ +），其細(xì)胞表面有性菌毛 不含F(xiàn) F因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F F- -），細(xì)胞表面沒有性菌毛 F F因子為附加體質(zhì)粒 既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（

4、整合）到染色體上 F F因子的四種細(xì)胞形式 a a）F F- -菌株， 不含F(xiàn) F因子，沒有性菌毛，但可以通過 接合作用接收 F F因子而變成雄性菌株（F F+ +）； b b）F F+ +菌株， F F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。 c c）HfrHfr菌株，F(xiàn) F因子插入到染色體DNADNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。 d d）FF菌株，HfrHfr菌株內(nèi)的F F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)， 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F F因子，特稱為FF因 子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。 1 1） F F+ +F F- -雜交 雜交的結(jié)果：給體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為F F+ +細(xì)胞 理化因子的處理可

5、將F F因子消除而使F F+ +菌株變成F F- -菌株 F F+ +菌株的F F因子向F F- -細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn) F因子的宿主細(xì)胞 的染色體DNADNA一般不被轉(zhuǎn)移。 Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組 ，由此而得名為高頻重組菌株。 2）Hfr F-雜交 Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F- 細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng)OriT序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)生 缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leading region)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì) 胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余

6、絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末 端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故 HfrF-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。 染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì) 就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。 F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故HfrF- 雜交后的受體細(xì)胞（或稱接合子）大多 數(shù)仍然是F-。 3）FF-雜交 Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)， 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子， 特稱為F因子。 FF-與F+F-的不同：給體的 部分染色體基因隨F一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 a）與染色體發(fā)生重組； b）繼續(xù)存在于F因子上， 形成一種部分二

7、倍體； 細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo) （F-duction），或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediated transduction）。 3.1.2 細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式： 一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中 能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA 帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型： 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) (1)(1)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transductiongeneralized transduction） 噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給體

8、染色體的任何部分到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 1) 1) 意外的發(fā)現(xiàn) 19511951年，Joshua LederbergJoshua Lederberg和Norton ZinderNorton Zinder為了證實(shí)大腸桿菌以外 的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型 的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)： 用“U U”型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在給體和受體細(xì)胞 不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！ 沙門氏菌LT22ALT22A是攜帶P22P22噬菌體的溶源性細(xì)菌 另一株是非溶源性細(xì)菌 一個(gè)表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致 一個(gè)驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！ 基因的傳遞很可能是由可透過“U U”

9、型管濾板的 P22P22噬菌體介導(dǎo)的 （普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn)） 管的中間用燒結(jié)玻璃濾板 隔開，它只允許液體和比 細(xì)菌小的顆粒通過 管的右臂放溶源性細(xì)菌 LA-22LA-22（受體），左臂放 敏感菌LA-2LA-2（供體） 用泵交替抽吸，使兩 端的液體來回流動(dòng) LA-22LA-22端出現(xiàn)了原養(yǎng)型 的個(gè)體（his+,try+his+,try+） 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 溶源性菌株LA-22 LA-22 中少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng) 過程中自發(fā)釋放出溫和型噬菌體P22 P22 通過濾板感染另一端的敏感菌株LA-2 LA-2 LA-2LA-2裂解后，產(chǎn)生大量的“可濾過因子 ”，其中極少數(shù)在成熟過程中包裹了 L

10、A-2LA-2的DNADNA片段( (含try+try+基因) ) 通過濾板再度感染LA-22 LA-22 重組后得到原養(yǎng)型（his+,try+his+,try+）的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 鼠傷寒沙門氏菌的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為什么“錯(cuò) ” 將宿主的DNADNA包裹進(jìn)去? ? 噬菌體的DNADNA包裝酶酶也能識(shí)別染色體DNADNA上類似pacpac的位點(diǎn) 并進(jìn)行切割，以“headfulheadful”的包裝機(jī)制包裝進(jìn)P22P22噬菌體外殼， 形成只含宿主DNADNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒（假噬菌體）。 因?yàn)槿旧w上的pacpac與P22 DNAP22 DNA的pacpac序列不完全相同， 利用效率較低，這種“錯(cuò)裝

11、”機(jī)率一般僅約1010-6 -6-10 -10-8 -8 形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的噬菌體可以是溫和的也可以是烈性的，但必須 具有能偶爾識(shí)別宿主DNADNA的包裝機(jī)制并在宿主基因組完全降解 以前進(jìn)行包裝。 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本要求： 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果： 進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體 的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortive transduction） 轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其 攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。 特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落 外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。 DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA， 而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。

12、(2)(2)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specialized transductionspecialized transduction） 溫和噬菌體感染 整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上 宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化 溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)， 在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主 基因因偶爾發(fā)生的不正常切 割而連在噬菌體DNADNA上 部分缺陷的溫和噬菌體 把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中 溫和噬菌體裂解時(shí)的 不正常切割：包含gal或bio基因 （幾率一般僅有10-6） 缺陷噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的DNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、 包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。 但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細(xì)胞后，通

13、過 DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別： a a）被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與噬菌體DNADNA連接，與噬菌體DNADNA一起 進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的 可能全部是宿主菌的基因。 b b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因 導(dǎo)入受體，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基 因具有隨機(jī)性。 溶源轉(zhuǎn)變（lysogenic conversionlysogenic conversion）： 一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象 溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因 整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象。

14、 溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？ a a）不攜帶任何供體菌的基因； b b）這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的； 3.1.33.1.3細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化（genetic transformationgenetic transformation） 定義：同源或異源的游離DNADNA分子( (質(zhì)粒和染色體DNA)DNA)被自然 或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程 自然遺傳轉(zhuǎn)化（natural genetic natural genetic transformationtransformation） 人工轉(zhuǎn)化（artificial transformationartificial trans

15、formation） 感受態(tài)細(xì)胞：具有攝取外源DNADNA能力的細(xì)胞 （competent cellcompetent cell） 自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？ 自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長階段的生理特性， 受細(xì)菌自身的基因控制； 人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有 攝取DNADNA的能力，或人為地將DNADNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 （該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)?。?(1)自然遺傳轉(zhuǎn)化（簡稱自然轉(zhuǎn)化） 1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae） 的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象 目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力 進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的

16、條件： 建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞 外源游離DNADNA分子 枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型） 分泌感受態(tài)因子 與細(xì)胞表面受 體M M相互作用 誘導(dǎo)特異蛋白質(zhì)如自溶素表達(dá) 使細(xì)胞表面的 DNADNA結(jié)合蛋白及 核酸酶裸露出來 ，使其具有與 DNADNA結(jié)合的活性 雙鏈DNADNA與感受態(tài)細(xì)胞表面的特定位 點(diǎn)吸附，DNADNA的一條單鏈被降解，另 一條單鏈進(jìn)入受體細(xì)胞，并與受體 細(xì)胞染色體DNADNA的同源部分配對(duì)，接 著受體染色體上相應(yīng)單鏈片段被切 除，并被外來的單鏈DNADNA交換、整合 和取代，形成雜種DNADNA， 自然轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)： a a）對(duì)核酸酶敏感； c c）轉(zhuǎn)

17、化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNADNA） 給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系； d d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多； 提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的二種方法： 1 1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有 活性的質(zhì)粒的幾率大大提高； 2 2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn) 化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌-重組獲救 b b）不需要活的DNADNA給體細(xì)胞； 噬菌體DNADNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒 轉(zhuǎn)染(transfection)(transfection)： 現(xiàn)在把DNADNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染 提純的噬菌體D

18、NADNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞 并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。 特點(diǎn)： 接合 (conjugation)(conjugation)： 細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F F因子介導(dǎo)） 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(transduction)： 由噬菌體介導(dǎo) 自然遺傳轉(zhuǎn)化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)： 游離DNADNA分子 + + 感受態(tài)細(xì)胞 “接合” “轉(zhuǎn)導(dǎo)” 及“自然轉(zhuǎn)化”這三種在自然界中 存在的細(xì)菌遺傳重組過程各自的特點(diǎn)： a）外源DNA的來源及進(jìn)入途徑有差異； b）決定因素也各有不同； (2)(2)人工轉(zhuǎn)化 用CaClCaCl2 2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。 在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段， 是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。 不是由細(xì)菌自身的基因所控制；