人上皮型鈣黏蛋白ECad酶聯(lián)免疫分析ELISA

1、如有幫助，歡迎下載。 人上皮型鈣黏蛋白（E-Cad酶聯(lián)免疫分析（ELISA 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)96t 目 的： 本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中人上皮型鈣黏蛋白（E-Cad的含 量。 檢測(cè)范圍： 5.0n g/L -100 ng/L 實(shí)驗(yàn)原理： 本試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中人上皮型鈣黏蛋白（E-Cad水平。用純化的抗 原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入人上皮型鈣黏蛋白（E-Cad）, 再與 HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。 顏色的深

2、淺和樣品中的人上皮型鈣黏蛋白（E-Cad呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下 測(cè)定吸光度（0D值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人上皮型鈣黏蛋白（E-Cad濃度。 試劑盒組成: Reage nt Qua ntity 酶標(biāo)包被板 12well x 8strips 標(biāo)準(zhǔn)品:480pg/mL 1 x 0.5ml 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1 x 1.5ml 酶標(biāo)試劑 1x 6ml 樣品稀釋液 1x 6ml 顯色劑A液 1x 6ml 顯色劑B液 1x 6ml 終止液 1x 6ml 30倍濃縮洗滌液 1 x 20ml x 30flod 說(shuō)明書(shū) 1 圭寸板膜 2 密封袋 1 樣本處理及要求： 1. 血清：室溫血液自然凝固

3、10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。 仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后， 離心20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成， 應(yīng)該再次離心。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清， 保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成

4、份時(shí)，用PBS（ PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì) 胞濃度達(dá)到100 萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS PH74用液氮迅速冷凍保 存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8 C的溫度。加入一定量的PBS（ PH7.4），用手工或 勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分 裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

5、。若不能 馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20 C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融. 7. 不能檢測(cè)含 NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRF）活性。 操作步驟: 1. 標(biāo)準(zhǔn)品：其濃度為1,00pg/mL （貯液）。先將其稀釋為100pg/mL （標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度）后，再 準(zhǔn)備5個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的 EP管，每個(gè)EP管中加入150卩L的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次 倍比稀釋成 100pg/mL, 50pg/mL,25pg/mL, 12.5pg/mL, 6.25pg/mL, 3.12pg/mL,，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （0pg/mL）直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 15

6、0 p 1 1501* 1 150 m 1 150 m 1 150 H I 5 Tube 0 1 2 3 4 5 pg/mL 1.00 50 25 12.5 6.25 3.12 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待 測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40卩l(xiāng)，然后再加待測(cè)樣品10 卩l(xiāng) （樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 溫育：用封板膜封板后置37C溫育 30分鐘。 4. 配液：將 20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗

7、滌液，靜置30秒后棄去， 如此重復(fù) 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50卩l(xiāng)，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3。 8. 洗滌：操作同5。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50卩I,再加入顯色劑B50卩I,輕輕震蕩混勻，37C避 光顯色15 分鐘. 10. 終止：每孔加終止液50卩l(xiāng)，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng) 在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 注意事項(xiàng)： 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后 1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 2 濃洗滌液可能會(huì)有

8、結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間 最好控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 4 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本0D 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 0D 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測(cè) 定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（X nx 5）。 5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6 底物請(qǐng)避光保存。 7 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) &所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 9 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。 計(jì)算： 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，0D 值為縱坐標(biāo)， 在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的0D 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與0D值計(jì)算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的0D值 代入方程