miRNA常用實(shí)驗(yàn)方法(20210424195120)

1、miRNA常用實(shí)驗(yàn)方法一、miRNA的檢測方法miRNA的 realtime-PCR 檢測方法1、realtime-PCR 引物設(shè)計(jì)miRNA realtime-PCR引物設(shè)計(jì)方法：1） stem-loop RT引物設(shè)計(jì)：基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端 6 個堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如設(shè)計(jì)miR-1 （ UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAT引物，只需在通用莖環(huán)序列后架上miRNA3末端的6個堿基的反向互補(bǔ)序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA

2、GGTATTCGCACTGGACACGAC2） realtime 上游引物設(shè)計(jì)：miRNA序列除去3端6個堿基的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為（注意把 U改為T） : TGGAATGTAAAGAAG查引物的 Tm值（一般參考DNAMA）如果Tm值較低，則在5端加GC使 Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設(shè)計(jì)為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT4 度。3）下游引物是通用的，序列為 GTGCAGGGTCCGAGGT4）弓|物設(shè)計(jì)好后，需要通過預(yù)試驗(yàn)檢測引物的特異性。一般需要做溶解曲線來檢測引物的特異性；同時最好將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測產(chǎn)物是否單一（因產(chǎn)物長度很小

3、，需要3姬上的瓊脂糖膠）。2、miRNA反 轉(zhuǎn)錄miRNA的反轉(zhuǎn)錄與一般基因的反轉(zhuǎn)錄過程基本相同。因?yàn)槠洚a(chǎn)物很短，用最普通的逆轉(zhuǎn)錄酶即可。我們一般使用的是 TIANGEN的 MLV逆轉(zhuǎn)錄體系為：RNA500ng2ug5xbuffer2uldNTP0.25ulDDT0.25ulRRI0.25ulMLV0.25ulRT primer 0.5ulH2O（RNase free） 補(bǔ)至 10ul程序?yàn)椋≒CR儀中通常命名為 CTFRT 16度，30min ; 42度，60min; 85度，5min ; 4度，hold。! !做miRNA的反轉(zhuǎn)錄時，注意不要忘記內(nèi)參的RT,即一個樣品至少要做目的miRNA

4、和內(nèi)參兩管反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。3、realtime-PCR 實(shí)驗(yàn)miRNA逆轉(zhuǎn)錄完成后得到的 cDNA即可進(jìn)行下一步 PCR在確認(rèn)引物的特異性后， 我們可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。一般每個樣品至少需要 3個平行孔。Realtime PCR體系為（ABI定量PCR儀需要加ROX dye II , Biorad 定量PCR儀不需要加 ROX：（Biorad 不加）2X SYBR 10 ulROX II 0.4ulPrimer 1ulTemplate 1ulH207.6ul（Biorad 8ul ）需要注意的幾點(diǎn)：1）在配制PCR體系時，請一定配制總體系，逐步分裝。每步分裝前充分 混勻。這一點(diǎn)是PCR平行性的保證。2

5、）配制體系盡量在冰上進(jìn)行。3）請選用比較準(zhǔn)確的槍進(jìn)行體系配制，并注意體系的冗余。一般來說，配制一整個96孔板的PCR體系，我會配制100個反應(yīng)的總量，保證分裝到最后稍有剩余。PCR程序：95度，1min； 95度，5s； 60度，34s （此步在讀取熒光值）。40到45個循環(huán)。4、realtime PCR 結(jié)果分析realtime PCR反應(yīng)結(jié)束后返回 Ct值，可以利用定量 PCF儀軟件自帶的程序進(jìn)行分析，也可 以利用EXCEL表格進(jìn)行相對定量計(jì)算。具體的計(jì)算方法：將三個平行孔的數(shù)值拷入到EXCEL表格的相應(yīng)位置，即可自動計(jì)算出相對值。注意，第一組樣品的值將被默認(rèn)為歸一為1。其他的樣品與之相比

6、得出相對值。EXCEL表格公式見附件。miRNA靶基因的預(yù)測miRNA靶基因預(yù)測軟件簡介1、TargetScan :11 / 10首先選擇預(yù)測的物種，如果要預(yù)測小鼠的miRNA和靶基因，則點(diǎn)擊右上角的“Go toTargetScanMouse ”。第二個選項(xiàng)可輸入基因名 （有時不識別別名），點(diǎn)擊submit即可，此操 作可預(yù)測可能靶向該靶基因的 miRNA或者輸入miRNA的名字，點(diǎn)擊submit，此操作可以預(yù) 測該miRNA的靶基因。2、 Pictar輸入網(wǎng)址后進(jìn)入pictar主頁，下面有幾個可選用的數(shù)據(jù)庫，一般選用最后兩個數(shù)據(jù)庫即可。 點(diǎn)擊進(jìn)入預(yù)測界面。選擇物種，選擇要預(yù)測的miRNA（注

7、意：如果你感興趣的miRNA在下拉菜單中未列出，則不可預(yù)測，可考慮換用其他軟件）并點(diǎn)擊search for targets of a miRNA或輸入gene ID （注意：與targetscan 不同，pictar 一般不識別基因名，最好輸入gene號：NM_* ）點(diǎn)擊 search for all miRNAs predicted to target a gene.進(jìn)行預(yù)測。3、Mirbase :分別輸入miRNA名或基因名即可進(jìn)行預(yù)測。其他選項(xiàng)不用更改。預(yù)測結(jié)果的處理和分析我們通常會將三種不同軟件的分析結(jié)果做比較，選取兩種以上軟件預(yù)測的交集部分作為我們候選的靶基因。如果這樣的結(jié)果仍然過多

8、，可以選取三種軟件預(yù)測的交集進(jìn)行下一步篩選。如果三種軟件預(yù)測的結(jié)果沒有交集部分，可以取并集，然后從中按功能提示進(jìn)行挑選。三、miRNA的過表達(dá)和敲低1、過表達(dá)過表達(dá)miRNA 般可采用兩種方法：a構(gòu)建過表達(dá)載體；b人工合成成熟miRNA a構(gòu)建過表達(dá)載體1) 獲取miRNA基因的序列及旁側(cè)序列進(jìn)入Ensembl()主頁。輸入 miRNA名，點(diǎn)擊進(jìn)入。在export data頁面上選擇輸入5 flanking sequenee和3 flanking sequenee分別為200bp（見下圖），然后點(diǎn)擊next即可得到包括前體和左右側(cè) 翼200bp的序列。2）基于這段序列，我們可以設(shè)計(jì)該miRNA

9、的表達(dá)序列。引物設(shè)計(jì)原則：擴(kuò)增產(chǎn)物包括前體，并左右各有至少 70bp的側(cè)翼序列，長度一般在200bp-500bp。其他同一般引物設(shè)計(jì)。載體可以選用任意使用 RNApolII識別的啟動子的載體，包括T7, CMV等。常用的是pcDNA3.1,不要帶標(biāo)簽的。注意：如果miRNA位于cluster中，則擴(kuò)增長度要控制，避免同時包括兩個 或兩個以上的 miRNA完成表達(dá)載體的克隆并測序確認(rèn)后，轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)檢測。如 果目的miRNA的表達(dá)明確，則載體構(gòu)建完成。b合成成熟的miRNA序列 查出miRNA的準(zhǔn)確序列，請公司合成成熟的序列。 常用的公司有: 上海吉凱；in vitroge n 等。2、

10、敲低目前做內(nèi)源性 miRNA的敲低一般使用人工合成的 miRNA的反義鏈，即成熟miRNA的序列的反 義互補(bǔ)序列。女口 mir-x 序列為 UCACACAACCCACCACCAU則G其inhibitor 序列為 CAAUGGUGGUGGGUUGUG將該序列送交公司合成即可。報告基因?qū)嶒?yàn)方法一、miRNA靶基因篩選熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)1熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建載體質(zhì)粒為經(jīng)過改造的pcDNA3.1,其圖譜見下圖。可用的酶切位點(diǎn)為 Notl ,Xhol及Xbal.推薦優(yōu)先使用XhoI和XbaI兩個酶切位點(diǎn)。如過不能用，可用Notl.XbalXhol三PWH_=進(jìn) 一q)EQ 一靶基因3 UTR的獲

11、得。3 UTF序列是指從Mrnaz終止密碼子后的第一個堿基開始到mRNA最后一個堿基（通常是 polyA結(jié)尾）。模板可采用相應(yīng)物種的 cDNA或基因組。在選擇模 板時要注意：一般來講，cDNA適于所有的3 UTR擴(kuò)增，但有時3端AT過多導(dǎo)致引物 設(shè)計(jì)困難時，可以考慮用基因組做模板。但是基因組做模板的前提是靶基因3 UTR由一個外顯子組成。相關(guān)信息可以從ensembl中查閱外顯子信息可以知道。一般盡可能全面的擴(kuò)增3 UTR但如果3 UTR過長或引物設(shè)計(jì)困難，可以選取包括miRNA結(jié)合位點(diǎn)的一段3 UTR引物設(shè)計(jì)的原則同一般引物設(shè)計(jì)。2、熒光素酶實(shí)驗(yàn)構(gòu)建好熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)后，準(zhǔn)備開始做報告基因

12、實(shí)驗(yàn)前，你還需要準(zhǔn)備以下材料：1）TK質(zhì)粒，作為共轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。2）miRNA的過表達(dá)質(zhì)?；蚝铣傻膍iRNA質(zhì)粒的濃度盡量在500ng/ul以上，合成的 miRNA稀釋到20uM。3）狀態(tài)良好的細(xì)胞。1）分細(xì)胞。我們常用 24孔板進(jìn)行報告基因?qū)嶒?yàn)。分細(xì)胞時保證細(xì)胞鋪板均勻（搖勻細(xì)胞 的方法見細(xì)胞培養(yǎng)的方法），每孔細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)。以293ET細(xì)胞為例，我們轉(zhuǎn)染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞密度可以稍高些，因?yàn)檗D(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡較多。2）轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時必須配總體系再依次分成小體系。這一步?jīng)Q定著每個孔的平行性和實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。轉(zhuǎn)染核酸用量為每孔：luc- 3 UTR 200ng T

13、K 50ng ； miRNA-pcDNA3.1 1ug或合成的 miRNA2.5ul （終濃度100nM）。Vig每孔用量為1ul，lip2000 為2ul。轉(zhuǎn)染后4-6h換液。如果用vig轉(zhuǎn)染必須及時換液，否則細(xì)胞會尸橫遍野。注意設(shè)立合理的對照，通常用 pcDNA3.1 （或 miRNA NC 代替 miRNA-pcDNA3.1（miRNA 做 miRNA的對照。3）收細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 24-48h可以收取細(xì)胞。用生理鹽水或PBS清洗細(xì)胞兩次，因 293細(xì)胞極易脫落，建議操作溫柔，如果對自己的操作沒有自信，可以增大生理鹽水量只洗一次。之后吸干生理鹽水。每孔加入80ul 1Xpassive buff

14、er（裂解液的量可視細(xì)胞數(shù)目稍作調(diào)整），室溫?fù)u20min，如果細(xì)胞裂解充分會看到白色粘稠狀細(xì)胞碎片。如果不馬上測，4）可連同24孔板凍于-80度， 測時再取出解凍。-20度可 保存一周。4度可保存一天。 測定熒光素酶活性。使用中 心實(shí)驗(yàn)室108室turner儀器 進(jìn)行雙熒光素酶的測量。具 體儀器操作方法可學(xué)習(xí)相關(guān) 教程或請教師兄師姐。我們 使用的試劑盒為 promega的 雙熒光素酶報告系統(tǒng)： bufferll為螢火蟲熒光素酶的底物，測量數(shù)值為我們 的報告基因的活性；S&G buffer 作用是淬滅螢火蟲 熒光素酶的活性并提供海腎 熒光素酶反應(yīng)的緩沖環(huán)境， 測定的數(shù)值為內(nèi)參的活性。測定時，取細(xì)

15、胞裂解液 8ul到96孔板中（專用的96孔板）上機(jī)測量。每種底物每孔加30ul 。3、結(jié)果分析測定熒光素酶后會返回三個值：螢火蟲熒光素酶活性、 海腎熒光素酶活性及兩者的比值。比值將作為最后的分析數(shù)據(jù)，反映了該孔報告基因的相對活性。通常將對照歸一為1，實(shí)驗(yàn)組與其相比取相對值。此相對值用于最后作圖和統(tǒng)計(jì)分析。歸一方法和作圖請自學(xué)EXCEL或請教其他同學(xué)。GFP報告基因?qū)嶒?yàn)GFP取代1、GFP報告基因質(zhì)粒構(gòu)建：與熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建方法同。僅僅是用luciferase 。2、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析1） 轉(zhuǎn)染。一般使用 12孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每孔轉(zhuǎn)染量：GFP-3 UTR 200ng-500ng ； mi

16、RNA 1ug質(zhì)?；?00nM合成的 miRNA2） 轉(zhuǎn)染48h后，用熒光顯微鏡照相， 觀察綠色熒光的強(qiáng)度；收取細(xì)胞，用GFP抗體檢測GFP表達(dá)水平。建議做三個平行孔，結(jié)果需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以判斷差異是否顯著。二、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控分析1、啟動子的預(yù)測、確認(rèn)啟動子是指RNA聚合酶識別并結(jié)合的 DNA序列，并包括促進(jìn)這一過程的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合 位點(diǎn)。啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，而真核基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通常需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確 定。5 RACE是確定基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的經(jīng)典方法。在不知道轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)時，我們也 可以對啟動子進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測基因啟動子的軟件有：NCBI promoter scan （） 等。2、轉(zhuǎn)錄因

17、子的預(yù)測通常我們比較關(guān)心哪些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控我們感興趣的基因，這就涉及到該基因的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測和鑒定。轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測軟件有：Sign alSca nTF search 等。將待預(yù)測的上游調(diào)控序列輸入進(jìn)行分析，即可知道該序列中含有哪些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位 點(diǎn)。（說明：這兩個軟件提供的預(yù)測結(jié)果不夠全，有一些轉(zhuǎn)錄因子沒有被包括其中。）3、報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建我們經(jīng)常使用的質(zhì)粒載體為 PGL-Basic，質(zhì)粒圖譜見下圖。我們要將待分析的啟動子序 列插入到luciferase基因上游。推薦使用kpnl，Xhol， BglII和HindIII 這幾個酶切位點(diǎn)，但不建議用XhoI和BglII雙酶切，因?yàn)檫@兩個酶切

18、位點(diǎn)有重合。該載體測序用RVP3（正向）和GLP2（反向）。2010 Sa.l 20C4 Mi HISV40 lte poly. A) sig詢(tor iuc+ reporter) 申ml 1002Xba I 1742Synthetic poly(A) signal / transcriptional pause site (for background reductiori)Sac I M/ul MM I Sma IXho BglUMridlllNeo I &6Mr I 1214、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析 常見的啟動子（轉(zhuǎn)錄因子）活性分析實(shí)驗(yàn)：1）連續(xù)截短確定核心啟動子。克隆基因的上游調(diào)控序列，做連續(xù)的截短，如構(gòu)建 -2000-150