微生物學(xué)第14章分支桿菌屬演示課件

1、第14章分枝桿菌屬潘建平 教授浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,結(jié)核病是一種古老的疾病。從新石器時(shí)代人類遺骨和古代木乃伊骨關(guān)節(jié)病理組織中，已發(fā)現(xiàn)人類在史前時(shí)代已患過(guò)結(jié)核病。 中國(guó)醫(yī)史中，結(jié)核病最早記載于內(nèi)經(jīng)并形容為“虛癆”之癥。古代文獻(xiàn)有提及肺癆為癆蟲(chóng)于肺所致，但未能確定致病的成因。,19世紀(jì)，結(jié)核病在歐洲和北美大肆流行，散布到社會(huì)的各個(gè)階層，生活困頓的人群成了結(jié)核病的溫床。而且是當(dāng)時(shí)造成死亡的主要原因，被人們稱為“巨大的白色瘟疫”。 許多當(dāng)年杰出的人物罹患結(jié)核?。貉┤R、席勒、勃朗寧、梭羅等。結(jié)核病的流行甚至影響了詩(shī)人和藝術(shù)家的思想。,德國(guó)科學(xué)家Robert Koch在1882年發(fā)現(xiàn)了一種特殊的微生物結(jié)核桿菌，

2、結(jié)核病的致病細(xì)菌。他還證明了這種微生物是可以在培養(yǎng)基里培養(yǎng)出來(lái)的。這一發(fā)現(xiàn)使得結(jié)核的實(shí)驗(yàn)研究成為現(xiàn)實(shí)。,世界結(jié)核病防治現(xiàn)狀,自發(fā)現(xiàn)MTB以來(lái)，全球約有兩億人死于TB，且疫情發(fā)展日趨嚴(yán)重。 WHO已將TB作為重點(diǎn)控制的傳染病之一，并于1995年起將每年的3月24日定為“世界防治結(jié)核病日”，以提醒公眾加深對(duì)TB的認(rèn)識(shí)。,據(jù)WHO預(yù)計(jì)，目前全球約20億人已感染了MTB。 全球現(xiàn)有TB病人2000萬(wàn)。 TB的死亡將達(dá)歷史最高水平，全球每天有8000人死于TB，每年約300萬(wàn)人死于TB 。特別是在發(fā)展中國(guó)家，TB的形勢(shì)尤其嚴(yán)峻，全球98的TB死亡和95的新發(fā)TB都是在發(fā)展中國(guó)家。,我國(guó)屬于全球22個(gè)TB

3、高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，TB的患病人數(shù)在世界各國(guó)中居于第2位。我國(guó)TB的流行具有“五多一高”的特點(diǎn)： MTB感染人數(shù)多。 現(xiàn)患肺TB病人多。 TB死亡人數(shù)多。 耐藥TB人多。 農(nóng)村TB人多。 傳染性肺TB患者疫情居高不下。,第一節(jié) 結(jié)核分枝桿菌,分枝桿菌屬（Mycobacterium）是一類細(xì)長(zhǎng)或稍彎的桿菌，因有分枝生長(zhǎng)的趨勢(shì)而得名。 結(jié)核桿菌引起結(jié)核病。對(duì)人類致病的有人型結(jié)核桿菌和牛型結(jié)核桿菌。,1.形態(tài)與染色 結(jié)核桿菌細(xì)長(zhǎng)略彎曲，端極鈍園，大小約140.4m，呈單個(gè)或分枝狀排列，無(wú)莢膜、無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。 在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀、串珠狀、短棒狀、長(zhǎng)絲形等。,一、生物學(xué)性狀,

4、抗酸染色（Ziehl-Neelsen）顯示痰標(biāo)本中染為紅色的特異性抗酸細(xì)菌（結(jié)核桿菌）。,其他非抗酸性細(xì)菌及細(xì)胞漿質(zhì)等呈藍(lán)色。結(jié)核桿菌的抗酸性取決于胞壁內(nèi)所含分枝菌酸殘基和胞壁固有層的完整性。,2.培養(yǎng)特性與生化反應(yīng),專性需氧菌 營(yíng)養(yǎng)要求高：在含有蛋黃、馬鈴薯、甘油和天門(mén)冬酰胺等的固體培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)。最適pH為6.56.8，最適溫度為37。 生長(zhǎng)緩慢：1824 h繁殖一代，接種后34周才出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落。菌落為干燥、堅(jiān)硬、表面呈顆粒狀、乳酪色或黃色，形似菜花樣。在液體培養(yǎng)基中呈粗糙皺紋狀菌膜生長(zhǎng)。 不發(fā)酵糖類：與牛分枝桿菌的區(qū)別在于前者可合成煙酸和還原硝酸鹽，而后者則不能。,結(jié)核桿菌培養(yǎng)的

5、菌落,（1）脂質(zhì)（Lipid）：占菌體干重2040%，占胞壁干重60%，主要是磷脂、脂肪酸和蠟質(zhì)，大多與蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合成復(fù)合物。,3.主要菌體成分及其作用,結(jié)核分枝桿菌無(wú)內(nèi)毒素，也不產(chǎn)生外毒素和侵襲性酶類，其致病作用主要靠菌體成分，特別是胞壁中所含的大量脂質(zhì)。脂質(zhì)含量與結(jié)核分枝桿菌的毒力呈平行關(guān)系，含量愈高毒力愈強(qiáng)。,磷脂： 能刺激單核細(xì)胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶組織溶解不完全，形成結(jié)核結(jié)節(jié)和干酪樣壞死。脂肪酸： 在脂質(zhì)中比重較大，與分枝桿菌抗酸性有關(guān)。其中6,6-雙分枝菌酸海藻糖具有破壞細(xì)胞線粒體膜，影響細(xì)胞呼吸，抑制中性粒細(xì)胞游走和吞噬，引起慢性肉芽腫的作用。具有該物質(zhì)的結(jié)

6、核桿菌毒株在液體培養(yǎng)基中能緊密黏成索狀，故稱索狀因子。,蠟質(zhì)D： 胞壁中的主要成分，是一種肽糖脂與分枝菌酸復(fù)合物，能引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并具有佐劑作用。 硫酸腦苷脂和硫酸多?；Ｔ逄牵?存在于結(jié)核分枝桿菌毒株細(xì)胞壁中，能抑制吞噬細(xì)胞中的吞噬體與溶酶體融合，使結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活。這類糖脂能結(jié)合中性紅染料產(chǎn)生中性紅反應(yīng)，借此可鑒定結(jié)核分枝桿菌有無(wú)毒力。,（2）蛋白質(zhì) 結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)，其中重要的是結(jié)核菌素（tuberculin）。結(jié)核菌素與蠟質(zhì)D結(jié)合，能引起較強(qiáng)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。（3）多糖 多糖常與脂質(zhì)結(jié)合存在于胞壁中，主要有半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖等。多糖可使中性粒細(xì)胞增

7、多，引起局部病灶細(xì)胞浸潤(rùn)。而多糖抗原是阿拉伯甘露聚糖，是分枝桿菌發(fā)生凝聚反應(yīng)的特異性表面抗原。（4）核酸 核糖體核糖核酸是本菌的免疫原之一，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫。,近年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞壁外尚有一層莢膜。一般因制片時(shí)遭受破壞而不易看到。若在制備電鏡標(biāo)本固定前用明膠處理，可防止莢膜脫水收縮，在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區(qū)，即莢膜。,（5）莢膜,主要成分為多糖，部分脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。 莢膜對(duì)結(jié)核分枝桿菌有一定保護(hù)作用：與吞噬細(xì)胞表面補(bǔ)體受體3（CR3）結(jié)合，有助于結(jié)核桿菌在宿主細(xì)胞上的粘附與入侵；莢膜中有多種酶可降解宿主組織中的大分子物質(zhì)，給入侵細(xì)菌提供繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)；防止宿主的有

8、害物質(zhì)進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌，甚至如小分子NaOH也不易進(jìn)入。,抵抗力較強(qiáng)：干痰中可存活68個(gè)月；在3HCl、6H2SO4或4NaOH溶液中能耐受30min，因而常以酸堿處理嚴(yán)重污染的樣本，殺死雜菌和消化粘稠物質(zhì)，以提高檢出率。,4.抵抗力,對(duì)濕熱、紫外線、乙醇的抵抗力弱。在液體中加熱6263 15 min或煮沸、直射日光下23 h、75%乙醇內(nèi)數(shù)分鐘即死亡。,5.變異性,對(duì)鏈霉素、利福平、異煙肼等抗結(jié)核藥物較易產(chǎn)生耐藥性，耐藥性菌株常伴隨活力和毒力減弱。 菌落、毒力等也易發(fā)生變異。 1908年Calmette和Gurin將有毒的牛分枝桿菌培養(yǎng)于含膽汁、甘油、馬鈴薯的培養(yǎng)基中，經(jīng)230次傳代，歷時(shí)1

9、3年，使其毒力發(fā)生變異，成為對(duì)人無(wú)致病性，而仍保持良好免疫原性的疫苗株，稱為卡介苗（Bacillus Calmette-Gurin，BCG）。,結(jié)核分枝桿菌無(wú)內(nèi)毒素，也不產(chǎn)生外毒素和侵襲性酶類，其致病作用可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)頑強(qiáng)增殖引起炎癥反應(yīng)，以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)性損傷有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)呼吸道、消化道和破損的皮膚黏膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官的結(jié)核病，以肺結(jié)核最為常見(jiàn)。,二、致病性與免疫性,1.原發(fā)感染 多見(jiàn)于兒童。隨飛沫和塵埃通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺泡。細(xì)胞內(nèi)寄生。 原發(fā)灶內(nèi)結(jié)核桿菌可經(jīng)淋巴管擴(kuò)散到肺門(mén)淋巴結(jié)（原發(fā)綜合征）。隨著機(jī)體免疫力的建立，原發(fā)灶大多可纖維化和

10、鈣化而自愈。 極少數(shù)免疫力低下者經(jīng)淋巴、血流擴(kuò)散至全身，導(dǎo)致全身粟粒性結(jié)核或結(jié)核性腦膜炎。,（一）肺部感染,多見(jiàn)于成年人。大多為內(nèi)源性感染，極少由外源性感染所致。由于機(jī)體已形成對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性細(xì)胞免疫，對(duì)再次侵入的結(jié)核分枝桿菌有較強(qiáng)的局限能力，故繼發(fā)感染的特點(diǎn)是病灶局限，一般不累及鄰近的淋巴結(jié)，主要表現(xiàn)為慢性肉芽腫性炎癥，形成結(jié)核結(jié)節(jié)，發(fā)生纖維化或干酪樣壞死。病變常發(fā)生在肺尖部位。,2.繼發(fā)感染,（二）肺外感染,部分肺結(jié)核患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌可經(jīng)血液、淋巴液擴(kuò)散侵入肺外組織器官，引起相應(yīng)的臟器結(jié)核，如腦、腎、骨、關(guān)節(jié)、生殖器官等結(jié)核。艾滋病等免疫力極度低下者，嚴(yán)重時(shí)可造成全身播散性結(jié)核

11、。痰菌被咽入消化道可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。通過(guò)破損皮膚感染結(jié)核分枝桿菌可導(dǎo)致皮膚結(jié)核。近年有許多報(bào)道，肺外結(jié)核標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌L型的檢出率比較高，應(yīng)引起足夠重視。,（三）免疫性與超敏反應(yīng),人類對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染率很高，但發(fā)病率卻較低，表明人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌有較強(qiáng)的免疫力。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，雖能產(chǎn)生多種抗菌體蛋白的抗體，但這些抗體僅對(duì)細(xì)胞外的細(xì)菌具有一定作用，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌不起作用。 結(jié)核分枝桿菌的免疫性與致病性均與結(jié)核分枝桿菌感染后誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的由T細(xì)胞介導(dǎo)的兩種免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，即細(xì)胞免疫和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。,1.免疫性,抗結(jié)核免疫力的持久性依賴于結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的存活，一

12、旦體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌消亡，抗結(jié)核免疫力也隨之消失，這種免疫稱為有菌免疫或傳染性免疫。 抗結(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫，包括致敏T細(xì)胞和M。致敏T細(xì)胞可殺死有結(jié)核桿菌的靶細(xì)胞，同時(shí)釋放多種淋巴因子（如TNF-、IFN-、IL-2、IL-6等），吸引NK、T、M等聚集炎癥部位，還能增強(qiáng)這類細(xì)胞的直接或間接殺菌活性。激活的M極大地增強(qiáng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬消化、抑制繁殖、阻止擴(kuò)散甚至徹底消滅的能力，充分發(fā)揮細(xì)胞免疫的作用。,2.超敏反應(yīng),機(jī)體獲得對(duì)結(jié)核桿菌免疫力的同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)與蠟質(zhì)D共同刺激T細(xì)胞，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)狀態(tài)。體內(nèi)致敏的T細(xì)胞再次遇到結(jié)核分枝桿菌時(shí)，即釋放出淋巴因子，引起強(qiáng)烈的遲發(fā)型

13、超敏反應(yīng)，形成以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)，容易發(fā)生干酷樣壞死，甚至液化形成空洞。,28,兒童結(jié)核病大多為初次感染，機(jī)體尚未建立免疫和超敏反應(yīng)，可發(fā)生急性全身粟粒性結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎。 成年人結(jié)核大多為復(fù)發(fā)或再次感染，此時(shí)機(jī)體已建立了抗結(jié)核分枝桿菌的免疫和超敏反應(yīng)性，病癥常為慢性局限性結(jié)核，不引起全身粟粒性結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎，但局部病癥較重，形成結(jié)核結(jié)節(jié)，發(fā)生纖維化或干酪樣壞死。,2.超敏反應(yīng)(續(xù)),3.結(jié)核菌素試驗(yàn),將一定量結(jié)核菌素注入皮內(nèi)，如受試者曾感染結(jié)核桿菌，則在注射部位出現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)炎癥，判為陽(yáng)性，未感染者則為陰性。此法可用于檢測(cè)可疑患者是否感染過(guò)結(jié)核菌、接種卡介苗后是否陽(yáng)轉(zhuǎn)以及

14、檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能。,結(jié)核菌素試劑有兩種： 舊結(jié)核菌素（old tuberculin，OT）： 含結(jié)核分枝桿菌的甘油肉湯培養(yǎng)物加熱過(guò)濾液，主要成分是結(jié)核蛋白，也含細(xì)菌的其他代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基成分。 純蛋白衍生物（purified protein derivative, PPD）：OT經(jīng)三氯醋酸沉淀后的純化物。,3.結(jié)核菌素試驗(yàn)（續(xù)）,方法： 目前多用PPD法。取PPD-C和BCG-PPD各5單位分別注入兩前臂皮內(nèi)，4872h后，紅腫硬結(jié)小于5mm者為陰性反應(yīng)；超過(guò)5mm者為陽(yáng)性；15 mm為強(qiáng)陽(yáng)性。,結(jié)果分析： 陽(yáng)性反應(yīng)表明機(jī)體已感染過(guò)結(jié)核枝桿菌或卡介苗接種成功，對(duì)結(jié)核桿菌有遲發(fā)型超敏反應(yīng)，說(shuō)

15、明有特異性免疫力。強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)則表明可能有活動(dòng)性結(jié)核病，尤其是嬰兒。陰性反應(yīng)表明未感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌或未接種過(guò)卡介苗。 原發(fā)感染早期、正患嚴(yán)重結(jié)核病或其他嚴(yán)重疾病致細(xì)胞免疫功能低下者（如用過(guò)免疫抑制者）也可能出現(xiàn)陰性反應(yīng)。,3.結(jié)核菌素試驗(yàn)（續(xù)）,應(yīng)用： 診斷嬰幼兒的結(jié)核?。?測(cè)定接種卡介苗后免疫效果； 在未接種卡介苗的人群作結(jié)核分枝桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查； 用于測(cè)定腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能。,3.結(jié)核菌素試驗(yàn)（續(xù)）,根據(jù)結(jié)核分枝桿菌感染的類型，應(yīng)采取病灶部位的適當(dāng)樣本。如肺結(jié)核取咳痰（最好取第一次晨痰，挑帶血或膿痰）；腎或膀胱結(jié)核以無(wú)菌導(dǎo)尿或取中段尿液；腸結(jié)核取糞便；結(jié)核性腦膜炎取腦脊液；膿胸、

16、肋膜炎、腹膜炎或骨髓結(jié)核等則穿刺取膿汁。,1直接涂片染色 咳痰、無(wú)菌采取的腦脊液、導(dǎo)尿或中段尿。 抗酸染色法 2分離培養(yǎng) 3動(dòng)物試驗(yàn)：豚鼠或地鼠 4結(jié)核分枝桿菌核酸及抗體檢測(cè)：PCR，ELISA,三、微生物學(xué)檢查法,預(yù)防： 接種卡介苗能極大降低結(jié)核病發(fā)病率。嬰兒出生后即接種，較大兒童須做結(jié)核菌素試驗(yàn)，陰性者接種。接種后68周結(jié)核菌素試驗(yàn)即可陽(yáng)性，陽(yáng)轉(zhuǎn)率可達(dá)9699%，表示接種者已有免疫力。陽(yáng)性反應(yīng)可維持約5年。 治療： 早期、聯(lián)合、足量、規(guī)范使用抗結(jié)核藥物。常用藥物有異煙肼、利福平、鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸鈉、乙胺丁醇等。,四、防治原則,第二節(jié) 麻風(fēng)分枝桿菌,麻風(fēng)分枝桿菌可引起麻風(fēng)病。該病是一種慢

17、性傳染病，世界各地均有流行。病菌可侵犯皮膚、黏膜和外周神經(jīng)組織，晚期可侵入深部組織和臟器，形成肉芽腫。從1985年以來(lái)，麻風(fēng)病在全球的流行已降低90%。1985年全球有122個(gè)國(guó)家呈地方流行，到2003年已減少至10個(gè)，集中在非、亞和拉丁美洲，高發(fā)國(guó)家為印度、尼泊爾和巴西。該病在我國(guó)僅剩二百余例。,形態(tài)上酷似結(jié)核分枝桿菌，亦表現(xiàn)明顯的抗酸染色特性，常在患者破潰皮膚滲出液的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，呈束狀排列。該菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，某些類型患者的滲出物標(biāo)本中可見(jiàn)大量麻風(fēng)分枝桿菌存在的感染細(xì)胞，這種細(xì)胞的胞質(zhì)呈泡沫狀，稱為泡沫細(xì)胞或麻風(fēng)細(xì)胞，這是與結(jié)核分枝桿菌感染的一個(gè)主要區(qū)別。 麻風(fēng)分枝桿菌是至今唯一不能人

18、工培養(yǎng)的細(xì)菌。以麻風(fēng)分枝桿菌感染小鼠足墊或接種至犰狳可引起動(dòng)物的進(jìn)行性麻風(fēng)感染，是研究麻風(fēng)病的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀?一、生物學(xué)性狀,麻風(fēng)分枝桿菌抗酸染色,自然狀態(tài)下麻風(fēng)分枝桿菌只侵害人，細(xì)菌由患者鼻分泌物及其他分泌物、精液或陰道分泌液中排出，故主要通過(guò)呼吸道、破損皮膚和密切接觸等方式傳播，家庭內(nèi)傳播多見(jiàn)。 流行地區(qū)人群多為隱性感染，幼年最敏感。潛伏期長(zhǎng)，平均25年，長(zhǎng)者可達(dá)數(shù)十年。發(fā)病緩慢，病程長(zhǎng)，遷延不愈。 根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化、細(xì)菌檢查等可將大部分患者分為瘤型麻風(fēng)和結(jié)核樣型麻風(fēng)；介于兩型之間的少數(shù)患者又可再分為兩類：界限類與未定類，兩類可向兩型轉(zhuǎn)化。,二、致病性與免疫性,1.涂片染色鏡檢 患者鼻黏膜或皮膚病變處取刮取物做涂片， 抗酸染色法檢查有無(wú)排列成束的抗酸桿菌存在。 一般瘤型和界限類患者標(biāo)本在細(xì)胞內(nèi)找到抗酸染 色陽(yáng)性桿菌有診斷意義，而結(jié)核樣型患者標(biāo)本中 則很難找到