椎間盤(pán)退變患者血清及髓核組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1及抑制劑1的表達(dá)

1、椎間盤(pán)退變患者血清及髓核組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1及抑制劑1的表達(dá)鄧 斌1，王葉新2，孟純陽(yáng)2(1鄒城市人民醫(yī)院骨外科，山東省濟(jì)寧市 ；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科，山東省濟(jì)寧市 )引用本文：鄧斌，王葉新，孟純陽(yáng). 椎間盤(pán)退變患者血清及髓核組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1及抑制劑1的表達(dá)J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(29):4303-4310.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.007 ORCID: 0000-0002-4454-0047(鄧斌)文章快速閱讀：對(duì)照觀察椎間盤(pán)退變患者血清及髓核組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1的表達(dá)鄧斌，男，1980年生

2、，山東省濟(jì)寧市人，漢族，山東中醫(yī)藥大學(xué)畢業(yè)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)、脊柱相關(guān)方面研究。中圖分類(lèi)號(hào):R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A文章編號(hào):2095-4344(2016)29-04303-08稿件接受：2016-04-28http:/WWW.MRI檢查分為：椎間盤(pán)輕度退變信號(hào)20例；椎間盤(pán)中度抑制信號(hào)20例；椎間盤(pán)嚴(yán)重退變信號(hào)20例；椎間盤(pán)退變患者60例單純椎體骨折20例0.050.例血清及髓核組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1的表達(dá)文題釋義：基質(zhì)金屬蛋白酶：基質(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。其家族

3、成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成：疏水信號(hào)肽序列；前肽區(qū)，主要作用是保持酶原的穩(wěn)定，當(dāng)該區(qū)域被外源性酶切斷后，基質(zhì)金屬蛋白酶酶原被激活；催化活性區(qū)，有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)酶催化作用的發(fā)揮至關(guān)重要；富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)；羧基末端區(qū)，與酶的底物特異性有關(guān)。其中酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)具有高度保守性。基質(zhì)金屬蛋白酶成員上述結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上各有特點(diǎn)，各種基質(zhì)金屬蛋白酶間具有一定的底物特異性，但不是絕對(duì)的。同一種基質(zhì)金屬蛋白酶可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，而某一種細(xì)胞外基質(zhì)成分又可被多種基質(zhì)金屬蛋白酶降解，但不同酶的降解效率可不同。腰椎退變：其實(shí)質(zhì)是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變，繼發(fā)以關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨質(zhì)以增殖性

4、新形成的一種關(guān)節(jié)病變。腰椎開(kāi)始退變后，首先出現(xiàn)椎間盤(pán)的變性，使椎間盤(pán)容易被壓縮而喪失其正常的高度，椎體間距離縮短、脊椎骨前后的韌帶因此而變得松弛，造成椎體之間的不穩(wěn)定，相互之間活動(dòng)過(guò)度。椎體間活動(dòng)度增大后，在椎體邊緣易于出現(xiàn)微小的、反復(fù)的、積累性損傷，可以導(dǎo)致微小的局部出血及滲出。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，出血及滲出被吸收纖維化，以后可逐步形成鈣化。摘要背景：基質(zhì)金屬蛋白酶現(xiàn)被公認(rèn)為能降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶分泌過(guò)多或金屬蛋白酶抑制劑的分泌減少能破壞細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。目的：試圖闡明基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1在椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制。方法：選擇60例椎間盤(pán)退變患者，根據(jù)磁共振(M

5、RI)檢查結(jié)果分為椎間盤(pán)有輕度的退變信號(hào)、椎間盤(pán)中度抑制信號(hào)及椎間盤(pán)嚴(yán)重的退變信號(hào)3個(gè)亞組；對(duì)照組20例椎體骨折(頸椎為主)但椎間盤(pán)正常的患者。在術(shù)前收集靜脈血液樣品，隨后收集病變的椎間盤(pán)組織。結(jié)果與結(jié)論：椎間盤(pán)退變組患者血清和組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶1水平顯著高于對(duì)照組(P 0.05)；在所有亞組之間的進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，重度椎間盤(pán)退變患者相比輕度或中度患者有較高的基質(zhì)金屬蛋白酶1表達(dá)水平(P 0.05)。金屬基質(zhì)蛋白酶1的表達(dá)在椎間盤(pán)退變患者中得到增強(qiáng)，金屬蛋白酶抑制劑1的表達(dá)與椎間盤(pán)退行性變無(wú)關(guān)。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；骨組織工程；椎間盤(pán)退變；基質(zhì)金屬蛋白酶1；金屬蛋白酶抑制劑1 主題詞：基質(zhì)金屬蛋

6、白酶類(lèi)；脊柱；椎間盤(pán)；組織工程Serum and tissue levels of matrix metalloproteinase-1 and its tissue inhibitor in patients with intervertebral disc degenerationDeng Bin1, Wang Ye-xin2, Meng Chun-yang2 (1Department of Orthopedics, Zoucheng Peoples Hospital, Jining , Shandong Province, China; 2 Department of Spine Sur

7、gery, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining , Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: Matrix metalloproteinases are now generally considered to be able to degrade all extracellular matrices. Hypersecretion of matrix metalloproteinases or reduction in tissue inhibitors of matr

8、ix metalloproteinases leads to destruction of the dynamic balance of extracellular matrix.OBJECTIVE: To elucidate the role of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in the pathogenesis and progression of intervertebral disc degeneration. METHODS: A total of 60

9、patients with intervertebral disc degeneration were included. Mild, moderate, and severe degeneration signals appeared on MRI imaging of the patients. Meanwhile, 20 patients with vertebral fracture, mainly cervical spine fracture, were selected as the control group. Venous blood samples were collect

10、ed before the surgery; the intervertebral disc specimens were sequentially collected.RESULTS AND CONCLUSION: Serum and tissue levels of matrix metalloproteinase-1 in patients with intervertebral disc degeneration were significantly increased compared with the control group (P 0.05), and furthermore

11、those were significantly increased in patients with severe disc degeneration compared with patients with mild and moderate disc degeneration (P 0.05). These results indicate that hypersecretion of matrix metalloproteinase-1 occurs in patients with intervertebral disc degeneration; however, the expre

12、ssion of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 is not correlated with intervertebral disc degeneration.Subject headings: Matrix Metalloproteinases; Spine; Intervertebral Disk; Tissue EngineeringCite this article: Deng B, Wang YX, Meng CY. Serum and tissue levels of matrix metalloproteinase-

13、1 and its tissue inhibitor in patients with intervertebral disc degeneration. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(29):4303-4310.Deng Bin, Master, Attending physician, Department ofOrthopedics, Zoucheng Peoples Hospital, Jining , ShandongProvince, China0 引言 Introduction根據(jù)美國(guó)骨傷病學(xué)會(huì)調(diào)查，1995年以來(lái)因椎間盤(pán)退變喪

14、失生活自理能力而使用輪椅的人僅次于腦血管病，名列“致殘率最高的頭號(hào)疾病第二位”！1。中國(guó)約有80%的成年人出現(xiàn)過(guò)腰腿疼。輕度椎間盤(pán)退變患者在出現(xiàn)酸脹、僵硬、腰腿疼痛、麻木、無(wú)力等癥狀后，由于治療不及時(shí)，會(huì)相繼出現(xiàn)痙攣性劇痛、行走困難、活動(dòng)受限等中度癥狀；嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致尿便失禁等2。通過(guò)分析椎間盤(pán)的病變過(guò)程發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)細(xì)胞基質(zhì)的合成與降解的失衡，會(huì)引起非聚合性蛋白多糖向更高濃度聚集，進(jìn)而減少與水分子的結(jié)合，出現(xiàn)失水、降低彈性；另外纖維化的膠原類(lèi)型越來(lái)越多的代替正常的膠原，也使椎間盤(pán)的彈性逐漸丟失3。在分子代謝水平上研究引起椎間盤(pán)退變的原因已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶是一組需要Zn2

15、+、Ca2+等金屬離子作為輔助因子的同工酶，其功能為參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，具有減少細(xì)胞外和基膜組分的作用，能降解除多糖以外幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，是降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶類(lèi)?；|(zhì)金屬蛋白酶的上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解升高，交替的膠原組分，纖維環(huán)的破損和椎間組織的損傷，最后導(dǎo)致髓核的變性，從而引起相應(yīng)的椎間盤(pán)病變的癥狀4。金屬蛋白酶抑制劑是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，也參與椎間盤(pán)的退變5。同基質(zhì)金屬蛋白酶家族類(lèi)似，金屬蛋白酶抑制劑也是一種多基因家族，至少包括4個(gè)成員。目前研究較多的是金屬蛋白酶抑制劑1和金屬蛋白酶抑制劑2，相對(duì)分子質(zhì)量分別是21 000和29 500，二者具有相關(guān)的氨基酸序列，均能以

16、非共價(jià)鍵形式與活性狀態(tài)的基質(zhì)金屬蛋白酶相結(jié)合，并因此抑制其活性。金屬蛋白酶抑制劑1可與所有活化狀態(tài)的基質(zhì)金屬蛋白酶相結(jié)合，但相比而言抑制基質(zhì)金屬蛋白酶1更為迅速有效，金屬蛋白酶抑制劑2則在抑制明膠酶A方面較金屬蛋白酶抑制劑1更有效。研究顯示金屬蛋白酶抑制劑的作用機(jī)制不但在于可直接與活化的基質(zhì)金屬蛋白酶相結(jié)合而抑制其活性，同時(shí)還可通過(guò)干擾后者的激活的過(guò)程而發(fā)揮有效的作用6。Baillet等7研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)的手術(shù)損傷可引起基質(zhì)金屬蛋白酶1的表達(dá)升高，這一結(jié)果提示了基質(zhì)金屬蛋白酶1參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并能夠被金屬蛋白酶抑制劑所抑制以減緩椎間盤(pán)退變的發(fā)生?；|(zhì)金屬蛋白酶分泌過(guò)多或者是金屬蛋白酶抑制

17、劑的分泌減少可破壞細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致椎間盤(pán)的退變。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)一系列研究發(fā)現(xiàn)，損傷的椎間盤(pán)組織中有大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，其表達(dá)水平與椎間盤(pán)損傷病情呈正相關(guān)的8-9?；|(zhì)金屬蛋白酶、金屬蛋白酶抑制劑的研究已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中顯示出其廣泛的應(yīng)用前景，而且其致病機(jī)制及應(yīng)用的研究成果還在不斷突破中。兩者在椎間盤(pán)退變患者中表達(dá)水平的測(cè)定，將為人們更加完整地提示椎間盤(pán)退變的規(guī)律和發(fā)生機(jī)制，為人類(lèi)進(jìn)行椎間盤(pán)退變的診斷防治和新藥開(kāi)發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外很少有學(xué)者同時(shí)研究基質(zhì)金屬蛋白酶及金屬蛋白酶抑制劑在椎間盤(pán)退變發(fā)生中的作用，因此在課題中大膽提出了二者在椎間盤(pán)退變中的聯(lián)合效用，并對(duì)此做出了相應(yīng)研

18、究。1 對(duì)象和方法 Subjects and methods 1.1 設(shè)計(jì) 病例-對(duì)照觀察試驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 病例來(lái)自于2013年3月至2014年9月鄒城市人民醫(yī)院骨外科。1.3 對(duì)象 1.3.1 椎間盤(pán)退變組入選標(biāo)準(zhǔn) 選擇60例椎間盤(pán)退變患者，男性30例，女性30例，年齡在22-55歲之間，平均為(35.61.8)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)磁共振(MRI)檢查，分為3個(gè)不同進(jìn)展階段：第1階段，椎間盤(pán)有輕度的退變信號(hào)；第2階段，椎間盤(pán)中度抑制信號(hào)；第3階段，椎間盤(pán)嚴(yán)重的退變信號(hào)。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)渭冏甸g盤(pán)退變的患者；對(duì)試驗(yàn)方案知情同意，且得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、

19、強(qiáng)直性脊柱炎的患者。1.3.2 對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn) 選擇了20例患者，年齡在21-56歲，平均為(34.72.2)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：外傷導(dǎo)致椎體骨折，經(jīng)X射線、CT或MRI檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)渭冏刁w(頸椎為主)骨折的患者。對(duì)試驗(yàn)方案知情同意，且得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：外傷導(dǎo)致椎間盤(pán)損傷的患者。1.4 方法1.4.1 血清蛋白水平測(cè)定 抽取患者的靜脈血，離心，分離取得上層血清，冷凍以供進(jìn)一步使用。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)之前，所有試劑均在室溫下預(yù)溫。用于基質(zhì)金屬蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1的ELISA試劑(Roche公司，瑞士)按照描述的手工方法使用。操作步驟：標(biāo)準(zhǔn)品

20、的稀釋?zhuān)涸噭┖刑峁┰稑?biāo)準(zhǔn)品一支，用戶(hù)可按照?qǐng)D表在小試管中進(jìn)行稀釋?zhuān)患訕樱悍謩e設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 L，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40 L，然后再加待測(cè)樣品10 L(樣品最終稀釋度為 5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻；溫育：用封板膜封板后置37 溫育30 min；配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用；洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 L，空白孔除外；溫育：操作同；洗滌：操

21、作同；顯色：每孔先加入顯色劑A50 L，再加入顯色劑B 50 L，輕輕震蕩混勻，37 避光顯色15 min；終止：每孔加終止液50 L，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)；測(cè)定：以空白孔調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以?xún)?nèi)進(jìn)行。每個(gè)濃度下制作5個(gè)重復(fù)樣本，然后洗滌，反應(yīng)和終止。參照使用標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制的基準(zhǔn)曲線，確定靶蛋白的濃度。1.4.2 免疫組織化學(xué)(IHC) 收集椎間盤(pán)退變患者及對(duì)照組的髓核組織樣本，并切成0.5 cm0.5 cm0.5 cm的小塊。在體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定，然后經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、脫蠟和復(fù)水后，用枸櫞酸緩沖液

22、進(jìn)行抗原修復(fù)。然后通過(guò)體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫酶處理切片，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。通過(guò)山羊抗血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，孵育1 h加入一抗，隨后孵育10 min加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗。切片脫水并蓋蓋玻片。圖像都由倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本)獲取。圖像分析：平行的陰性對(duì)照組中用PBS代替一抗。獲取圖像后，一張玻片隨機(jī)選取5個(gè)視野。在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中，基質(zhì)金屬蛋白酶1或金屬蛋白酶抑制劑1陽(yáng)性信號(hào)表現(xiàn)為深棕/黃棕色顏色，在細(xì)胞核中不出現(xiàn)。計(jì)算一個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，并獲得5個(gè)視野陽(yáng)性百分率的平均值。染色被定義為4個(gè)等級(jí)：陰性(-)：10%的陽(yáng)性細(xì)胞；弱陽(yáng)性(+)：11%-25%的陽(yáng)性細(xì)胞；陽(yáng)

23、性(+)：26%-50%的陽(yáng)性細(xì)胞；強(qiáng)陽(yáng)性(+)：超過(guò)50%的陽(yáng)性細(xì)胞。全部陽(yáng)性率被定義為：每組中、級(jí)樣本數(shù)之和/總樣本數(shù)。1.5 主要觀察指標(biāo) 血清及組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1的表達(dá)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理所有收集到的數(shù)據(jù)，其中運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料，運(yùn)用方差分析(ANOVA)分析計(jì)量資料。組間對(duì)比運(yùn)用LSD檢驗(yàn)。所有測(cè)量數(shù)據(jù)均表示為s。當(dāng)P 0.05表注：說(shuō)明兩組患者在性別、年齡差異沒(méi)有顯著性意義。2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1的血清水平 使用ELISA來(lái)測(cè)定椎間盤(pán)退變組和對(duì)照組血清中基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1的水平。結(jié)

24、果發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)退變患者組基質(zhì)金屬蛋白酶1的水平高于對(duì)照組(P 0.05，圖1A)。進(jìn)一步比較椎間盤(pán)退變的3個(gè)亞組，發(fā)現(xiàn)第3階段(嚴(yán)重椎間盤(pán)退變)的患者血清金屬基質(zhì)蛋白酶1水平比那些在第1階段(輕度)或第2階段(中度)的患者顯著增高，差異有顯著性意義(P 0.05，圖1B)。2.4 基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1蛋白在組織中的表達(dá) 進(jìn)一步用IHC染色檢查基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1蛋白在對(duì)照組和椎間盤(pán)退變組中表達(dá)的差異。顯微圖像表明，對(duì)照組細(xì)胞形狀不規(guī)則，含有藍(lán)色圓形細(xì)胞核，粉紅色的細(xì)胞質(zhì)和均勻分布的細(xì)胞外基質(zhì)。然而椎間盤(pán)退變組的組織中是圓形細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中含有空泡，細(xì)胞外基質(zhì)中纖維

25、分散，細(xì)胞增殖顯著升高(圖2)?；|(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1都表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中并顯示為褐色和黃色的顆粒。3個(gè)椎間盤(pán)退變組的金屬基質(zhì)蛋白酶1陽(yáng)性率較對(duì)照組顯著增高(表2，P 0.05)；和第1階段或第2階段相比，椎間盤(pán)退變第3階段患者具有最高(95%)的金屬基質(zhì)蛋白酶1陽(yáng)性率(P 0.05)。3 討論 Discussion椎間盤(pán)退變是退行性椎間盤(pán)突出的前提條件，椎間盤(pán)退變的主要表現(xiàn)為蛋白多糖的降解和合成的減少、髓核含水量的逐漸減少，進(jìn)而造成椎間盤(pán)的彈性和抗負(fù)荷能力減退10-11。由于椎間盤(pán)突出癥的顯著病理改變，臨床上表現(xiàn)的癥狀包括頸部、腰腿部疼痛和疲勞。通過(guò)體格檢查，則會(huì)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)支

26、配區(qū)域的感覺(jué)麻痹、喪失，偶可見(jiàn)感覺(jué)異常、感覺(jué)過(guò)敏、肌肉萎縮、尿便功能異常、神經(jīng)牽拉疼痛。脊髓型脊椎病還會(huì)出現(xiàn)下肢肌張力升高、共濟(jì)失調(diào)。由椎間盤(pán)的解剖和組織學(xué)知識(shí)可知：腰椎間盤(pán)的位置位于兩個(gè)椎體之間，是一個(gè)具有流體力學(xué)特性的結(jié)。椎間盤(pán)由髓核、纖維環(huán)和軟骨板3部分構(gòu)成，其中中央部分為髓核，纖維環(huán)為周?chē)糠?，包繞髓核，軟骨板為上、下部分，直接與椎體骨組織相連，整個(gè)腰椎間盤(pán)的厚度為8-10 mm。椎間盤(pán)的退變，繼而出現(xiàn)了纖維環(huán)的斷裂和髓核的突出，通過(guò)力學(xué)或化學(xué)的因素刺激神經(jīng)根引起上述癥狀及體征12。以往認(rèn)為椎間盤(pán)退變是一種單純的生物力學(xué)現(xiàn)象，但現(xiàn)在的研究結(jié)論認(rèn)為生物力學(xué)的作用是次要的，更強(qiáng)調(diào)生物化學(xué)機(jī)

27、制，也就是炎癥因子導(dǎo)致的無(wú)菌性炎癥發(fā)揮著至關(guān)重要的作用13-15。 B金屬蛋白酶抑制劑1(g/L)50.100.050 A基質(zhì)金屬蛋白酶1(g/L)0.20.10對(duì)照組 1階段 2階段 3階段 (輕度) (中度) (重度)對(duì)照組 1階段 2階段 3階段 (輕度) (中度) (重度)圖1 基質(zhì)金屬蛋白酶1及金屬蛋白酶抑制劑1在椎間盤(pán)退變組及對(duì)照組中的表達(dá)Figure 1 Serum levels of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1

28、in both groups圖注：圖中A為基質(zhì)金屬蛋白酶1表達(dá)；B為金屬蛋白酶抑制劑1表達(dá)。 A B C D E F圖2 髓核組織的免疫組化染色下基質(zhì)金屬蛋白酶1蛋白和金屬蛋白酶抑制劑1蛋白在退變組和對(duì)照組中的表達(dá)(箭頭指陽(yáng)性細(xì)胞)Figure 2 Immunoreactivities for matrix metalloproteinase-1 and its tissue inhibitor in nucleus pulposus tissue in both groups (arrows show matrix metalloproteinase-1-immunoreactive cel

29、ls) 圖注：圖A，B，C分別為基質(zhì)金屬蛋白酶1蛋白在椎間盤(pán)退變組第1，2，3階段中的表達(dá)(IHC，400)；D為基質(zhì)金屬蛋白酶1蛋白在椎間盤(pán)對(duì)照組中的表達(dá)(IHC，400)；E，F(xiàn)分別為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1蛋白在椎間盤(pán)退變組和對(duì)照組中的表達(dá)(IHC，100)表2 基質(zhì)金屬蛋白酶1 和金屬蛋白酶抑制劑1在椎間盤(pán)退變組及對(duì)照組中的表達(dá) Table 2 Tissue levels of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in both groups組別n基質(zhì)金屬蛋白酶1金屬蛋

30、白酶抑制劑1-+-+陽(yáng)性率(%)-+-+陽(yáng)性率(%)椎間盤(pán)退變組60第1階段20107350a145130第2階段2069570a136135第3階段20111895ab126240對(duì)照組201820101010020表注：基質(zhì)金屬蛋白酶1蛋白的濃度在椎間盤(pán)退變患者中的表達(dá)是升高的，特別在椎間盤(pán)退變第3階段的患者可以更明確的觀察到。金屬蛋白酶抑制劑1的表達(dá)在椎間盤(pán)退變過(guò)程中沒(méi)有明顯的特別不同之處。與對(duì)照組比較，aP 0.05；與椎間盤(pán)病變的階段I、階段 II比較，bP 0.05。髓核組織由髓核細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，髓核細(xì)胞主要是軟骨細(xì)胞，數(shù)量非常少。而細(xì)胞外基質(zhì)在椎間盤(pán)中占絕大部分，約占99%

31、，椎間盤(pán)外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)取決于組成物質(zhì)合成、更新及修復(fù)的能力，椎間盤(pán)細(xì)胞合成蛋白多糖、膠原纖維及其他成分明顯減少，或者修復(fù)破壞的椎間盤(pán)物質(zhì)能力降低，使基質(zhì)發(fā)生改變而出現(xiàn)椎間盤(pán)的退變16。椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)主要成分是蛋白多糖，它可以與膠原相互作用以形成穩(wěn)定的外基質(zhì)，具有潤(rùn)滑并具有減少椎間隙壓力的作用17-18。椎間盤(pán)中不同部位的膠原含量不同，主要類(lèi)型是型和型，約占80%。在纖維環(huán)中，膠原纖維主要由型膠原(80%)和型膠原構(gòu)成，型次之，并含有少量，和型膠原。而髓核中的細(xì)胞如透明狀的軟骨細(xì)胞主要合成型膠原，約占80%，而沒(méi)有型膠原，但是也包含型膠原(占15%-20%)，型膠原(占1%-2%)及型膠原(

32、約3%)19-20。和型膠原是由類(lèi)成纖維細(xì)胞合成，而型膠原是由軟骨細(xì)胞合成，因此，型膠原主要見(jiàn)于外成纖維環(huán)，過(guò)渡區(qū)則包括了所有的型膠原。椎間盤(pán)中的蛋白多糖與關(guān)節(jié)軟骨中的多聚糖相似，含有硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素富含區(qū)及N-端球形核心蛋白區(qū)，以便使其通過(guò)連接蛋白和透明質(zhì)酸結(jié)合成聚合體。膠原網(wǎng)和蛋白多糖共同維持髓核的黏膠狀態(tài)。蛋白多糖及核心蛋白的表達(dá)在髓核最高，由內(nèi)向外逐漸減弱，且隨著年齡的增長(zhǎng)其表達(dá)出現(xiàn)降低趨勢(shì)，蛋白多糖逐漸被富含膠原的纖維組織所替代，最后導(dǎo)致髓桉纖維化，水分隨之喪失。變性的髓核組織彈性消失，硬度增加，失去均勻傳遞壓力的作用，髓核易于纖維環(huán)薄弱處突出。最近的研究表明細(xì)胞因子和炎癥因子

33、在椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用21?，F(xiàn)已知基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)腰椎間盤(pán)組織中細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解進(jìn)行調(diào)節(jié)，而且與椎間盤(pán)退變形成密切相關(guān)4，22。作為存在于細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)由膠原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物質(zhì)組成。這些大分子物質(zhì)可與細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合，通過(guò)受體與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)直接發(fā)生聯(lián)系或觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)傳導(dǎo)而引起不同的基因表達(dá)23-24，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。作為降解細(xì)胞外基質(zhì)成分最重要的酶-基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子在這一過(guò)程中起著非常重要的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類(lèi)依賴(lài)金屬離子鋅并以細(xì)胞外基質(zhì)成分為水解底物的蛋白水解酶25-26，其在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

34、受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及激素等因素的嚴(yán)格調(diào)控，在蛋白質(zhì)水平其活性也受到其激活劑和抑制劑的調(diào)節(jié)?；|(zhì)金屬蛋白酶通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的水解來(lái)影響其降解與重組的動(dòng)態(tài)平衡而參與多種細(xì)胞的生理和病理過(guò)程27?；|(zhì)金屬蛋白酶的上調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解升高，交替的膠原組分，纖維環(huán)的破損和椎間組織的損傷，最后導(dǎo)致髓核的變性28。Bachmeier等29研究表明，在椎間盤(pán)退變的過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶1的信使RNA表達(dá)都有增加，認(rèn)為可以作為基質(zhì)金屬蛋白酶的代表，是生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶。Kanemoto等30用免疫組織化學(xué)的方法表明，突出椎間盤(pán)中的基質(zhì)金屬蛋白酶3比非突出的多，而脫出和游離性的

35、更多，有顯著性差異，非突出椎間盤(pán)和突出型的椎間盤(pán)中的金屬蛋白酶抑制劑1為陰性，反而脫出型和游離型中為陽(yáng)性，但差異無(wú)顯著性，也提示基質(zhì)金屬蛋白酶3和金屬蛋白酶抑制劑1的不平衡表達(dá)，也許是椎間盤(pán)退變的因素?；|(zhì)金屬蛋白酶在椎間盤(pán)退變的調(diào)節(jié)是多因素、多水平的調(diào)節(jié)，包括激活/抑制因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子及椎間盤(pán)細(xì)胞的調(diào)節(jié)，并依賴(lài)于其特異性抑制因子在組織里的含量。此外，細(xì)胞外基質(zhì)被基質(zhì)金屬蛋白酶降解的同時(shí)，伴有新基質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用不斷的改變，因此反饋調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的合成與激活狀態(tài)。以往的文章認(rèn)為椎間盤(pán)損傷主要原因是由于基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑之間的不平衡所導(dǎo)致椎間盤(pán)基

36、質(zhì)的過(guò)度降解31-32。金屬蛋白酶抑制劑是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，可以通過(guò)一對(duì)一復(fù)合體的形成抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性33。在這項(xiàng)研究中，作者把所有的椎間盤(pán)退變患者根據(jù)MRI信號(hào)強(qiáng)度的不同分成3個(gè)階段(輕度，中度和重度)。收集所有參與者術(shù)前靜脈血樣本，并測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶抑制劑1水平。結(jié)果表明，椎間盤(pán)退變患者血清中的基質(zhì)金屬蛋白酶1的水平相對(duì)于對(duì)照組顯著增高。同時(shí)在進(jìn)一步的組內(nèi)比對(duì)表明，嚴(yán)重的椎間盤(pán)退變患者的表達(dá)水平相對(duì)輕度或中度的患者有明顯升高。但是金屬基質(zhì)蛋白酶的水平在椎間盤(pán)退變組和對(duì)照組個(gè)體之間沒(méi)有顯著差異。免疫組織化學(xué)得到類(lèi)似的結(jié)果：嚴(yán)重椎間盤(pán)退變患者比那些中度或輕度患者有

37、顯著增高的基質(zhì)金屬蛋白酶1陽(yáng)性率；所有患者基質(zhì)金屬蛋白酶1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增高；金屬蛋白酶抑制劑在所有的組中具有相似的水平。所有這些結(jié)果表明，椎間盤(pán)退變患者的屬基質(zhì)蛋白酶1表達(dá)升高明顯，特別是在相對(duì)嚴(yán)重的個(gè)體，而金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)則基本相同。其他研究也為作者的結(jié)果提供了支持，表明損傷的椎間盤(pán)組織中有大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，其表達(dá)水平與椎間盤(pán)損傷病情呈正相關(guān)的。Baillet等7研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)的手術(shù)損傷可導(dǎo)致金屬基質(zhì)蛋白酶1的表達(dá)升高7，34，提示后者參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并能夠被金屬蛋白酶抑制劑抑制以減緩椎間盤(pán)退變的發(fā)生。一些研究將椎間盤(pán)退變產(chǎn)生歸因于細(xì)胞因子和炎性因子的釋放，這兩者

38、都可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶1的升高和金屬蛋白酶抑制劑1的降低35。雖然上述兩者在退行性和正常椎間盤(pán)組織都表達(dá)，但是顯然在退化性椎間盤(pán)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1顯著升高，金屬蛋白酶抑制劑1降低引起了細(xì)胞外基質(zhì)降解的不平衡。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)降低的金屬蛋白酶抑制劑水平無(wú)法抑制金屬基質(zhì)蛋白酶的時(shí)候，導(dǎo)致了椎間盤(pán)彈性降低和椎間盤(pán)突出36。所有這些結(jié)果與作者的研究是一致的。此次研究病例數(shù)較少，且來(lái)源于同一地區(qū)同一家醫(yī)院就診患者，試驗(yàn)時(shí)間跨度較短，可能存在選擇偏倚，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上所述，基質(zhì)金屬蛋白酶1在椎間盤(pán)病變的進(jìn)展中表達(dá)較高，和椎間盤(pán)病變的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。然而，金屬蛋白酶抑制劑1在正常和退行性椎間盤(pán)組

39、織中均表達(dá)。基質(zhì)金屬蛋白酶1/金屬蛋白酶抑制劑1表達(dá)失平衡及髓核外基質(zhì)中膠原的降解是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變發(fā)病的一個(gè)重要原因，能加速椎間盤(pán)的退變過(guò)程，最終表現(xiàn)為椎間盤(pán)內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少和功能降低，聚合蛋白聚糖和主要膠原進(jìn)行性減少。因此調(diào)節(jié)上述兩者的相對(duì)表達(dá)以及進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝可能為治療椎間盤(pán)突出癥提供新的戰(zhàn)略方案，隨著未來(lái)研究的進(jìn)展，明確基質(zhì)金屬蛋白酶活化的具體機(jī)制，從基因或分子生物水平調(diào)節(jié)后者的活化進(jìn)程，阻止或延緩椎間盤(pán)退變，從根本上治療椎間盤(pán)退變。致謝：衷心感謝王葉新在文章立題和設(shè)計(jì)時(shí)給予的悉心指導(dǎo)。作者貢獻(xiàn)：鄧斌、孟純陽(yáng)、王葉新共同負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估及資料收集。利益沖突：所有作者共同認(rèn)

40、可文章無(wú)相關(guān)利益沖突。倫理問(wèn)題：知情同意：參與試驗(yàn)的受檢者均自愿參加，在充分了解試驗(yàn)方案的前提下簽署“知情同意書(shū)”，干預(yù)及治療方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。醫(yī)生資質(zhì)：臨床試驗(yàn)參研人員都具有專(zhuān)業(yè)技術(shù)職稱(chēng)，有從事椎間盤(pán)退行性變?cè)\治、治療等領(lǐng)域的工作經(jīng)驗(yàn)。課題實(shí)施者均為臨床醫(yī)師，經(jīng)過(guò)相關(guān)培訓(xùn)，具有從事椎間盤(pán)退變?cè)\治工作所要求的資質(zhì)。文章查重：文章出版前已經(jīng)過(guò)CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專(zhuān)家雙盲審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)（包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)）記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷(xiāo)

41、毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 Baliga S,Treon K,Craig NJ.Low Back Pain: Current Surgical Approaches. Asian Spine J. 2015;9(4): 645-657. 2 黃慶華.椎間盤(pán)退變分子機(jī)制的研究進(jìn)展J.醫(yī)學(xué)信息(中旬刊).2011,24(4)：1672-1674.3 Lotz JC,Colliou OK,Chin JR,et al. Compression- induced changes in intervertebral d

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