現(xiàn)代科技綜述知識文庫：熒光分光光度法

1、現(xiàn)代科技綜述系列熒光分光光度法科技是人類區(qū)別于動物的重要文明之一，是人類對自然規(guī)律研究和利用的學(xué)科。本文提供對科技基本概念“熒光分光光度法”的解讀，以供大家了解。熒光分光光度法熒光分析法具有靈敏度高，選擇性強(qiáng)，用樣量少和方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，不但是基礎(chǔ)理論研究的有效工具，而且在工、農(nóng)、醫(yī)、環(huán)保、化工、冶金、地質(zhì)等領(lǐng)域也是重要的分析方法之一。當(dāng)用一種波長的光照射某種物質(zhì)時，這個物質(zhì)會在極短的時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長為長的光，這種光稱為熒光。早在16世紀(jì)，人們就注意到植物抽提液和礦物的熒光發(fā)射。1852年，斯托克斯(Stockes)闡明了熒光發(fā)射的機(jī)制。熒光的產(chǎn)生是由于某些物質(zhì)分子吸收電磁波能量，由基態(tài)躍

2、遷到較高的能級(激發(fā)態(tài))后，首先通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程損耗一部分能量，回到第1電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，同時以光量子的形式發(fā)射能量，即為熒光。熒光發(fā)射的量子能量小于入射光量子能量，所以熒光波長大于激發(fā)波長。產(chǎn)生熒光的過程很快，約在108s內(nèi)完成。一旦除去激發(fā)光(入射光)，熒光也隨之消失。熒光分析能提供較多的參數(shù)，從各個角度反映分子的發(fā)光特性。通過對這些參數(shù)的分析，不但可以做一般的定量測定，而且還可以推斷分子在各種環(huán)境中的構(gòu)象變化，從而了解大分子的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，這些參數(shù)包括：1激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。這是熒光光譜的兩個最基本的參數(shù)。激發(fā)光譜是引起熒光的激發(fā)輻射在不同波長的相對效率。發(fā)射光譜即是分子吸收光能

3、量后再發(fā)射的結(jié)果。根據(jù)激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的形狀和強(qiáng)度可對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。如欲得到物質(zhì)的真實(shí)熒光光譜(又稱校正熒光光譜)，必須設(shè)法消除儀器中光源、單色器、檢測器等光學(xué)元件的光譜特性對物質(zhì)的熒光光譜的影響。2斯托克斯(Stockes)位移。單位是cm1，ex和em分別是校正后的最大發(fā)波長和最大激發(fā)射波長，單位是nm。3熒光強(qiáng)度和總熒光量。熒光強(qiáng)度用來表示熒光的相對強(qiáng)弱，所用的是任意單位，測定一個物質(zhì)的相對熒光強(qiáng)度F與很多因素有關(guān)：F=KIo(1ebc)=KIo(1eA)這里K是儀器常數(shù)，是量子產(chǎn)率，Io是激發(fā)光強(qiáng)度，是摩爾吸光系數(shù)，b是樣品池的光徑，C是樣品的濃度，A是樣品的吸光度。當(dāng)A很

4、小時，F(xiàn)=KIoA。當(dāng)A增加至一定值時，F(xiàn)不但不隨A的增加而增加，甚至隨A增加而減少，這就是所謂的濃度淬滅現(xiàn)象。總熒光量即發(fā)射光譜的面積。4量子產(chǎn)率。表示物質(zhì)發(fā)射熒光的本領(lǐng)，用表示。其定義為發(fā)射量子數(shù)與吸收量子數(shù)之比。濃度、溫度、溶劑、激發(fā)波長和熒光標(biāo)準(zhǔn)的選擇都會影響量子產(chǎn)率測定的準(zhǔn)確性。1924年，惠維羅(Wawillow)首先進(jìn)行量子產(chǎn)率的測定。20世紀(jì)50年代前后大多用絕對法來測定，方法繁瑣，容易引入誤差?，F(xiàn)在大多用派克(Parker，1960)和陳(RFchen 1965)提出的相對法。5熒光偏振。如果將一個熒光物質(zhì)放在熒光儀的起偏器和檢偏器之間，就能測出它旋轉(zhuǎn)電矢量的能力。由此可以計(jì)

5、算分子的形狀、大小、運(yùn)動狀態(tài)等。熒光偏振用P表示，F(xiàn)11是起偏器和檢偏器的矢量方向互相平行時測出的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是它們的電矢量方向互相垂直時測出的熒光強(qiáng)度，G為校正因子，是水平偏振光對垂直偏振光的透射效率之比。6熒光壽命。當(dāng)去掉激發(fā)光后，分子的熒光強(qiáng)度(It)降到激發(fā)時最大熒光強(qiáng)度Io的1e所需要的時間(t)，稱為熒光壽命，常用表示。It=Ioet熒光分析儀器大致包括熒光分析燈、濾片熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)三大類。它們通常由光源、激發(fā)單色器、樣品室、發(fā)射單色器、檢測器、放大器和記錄顯示裝置組成。(1)光源：熒光分析燈和濾片熒光計(jì)的光源通常采用汞燈或氘燈和鎢燈。但熒光分光光度計(jì)的光源通常用氙燈，它發(fā)

6、射從紫外到近紅外的連續(xù)光譜。(2)單色器：熒光分析燈和濾片熒光計(jì)采用濾片作為單色元件，因而只能得到發(fā)射光譜的總熒光量，不能掃描熒光光譜。熒光分光光度計(jì)大多采用光柵作為分光元件。單色器的單色性影響光譜分辨率。(3)樣品室：樣品室中安放各種熒光池。由樣品發(fā)射的熒光通常在與入射的激發(fā)光成直角方向被檢測。(4)檢測器：簡單的熒光分析器常用光電管作檢測器。熒光分光光度計(jì)則用光電倍增管作檢測器，它把微弱的熒光信號轉(zhuǎn)換成電信號且放大數(shù)十萬乃至數(shù)百萬倍，以供定性定量測定。(5)放大及記錄顯示：把光電倍增管輸出的電信號送到前置放大器和主放大器放大，最后用表頭、記錄儀或屏幕顯示其光譜或數(shù)據(jù)。熒光分析的靈敏度很高，

7、它比吸收光譜法靈敏度高2到3個數(shù)量級，能檢測1012g的物質(zhì)。利用熒光物質(zhì)本身的熒光可以直接進(jìn)行檢測，稱為直接測定法或內(nèi)源熒光法。有些物質(zhì)本身不發(fā)熒光或量子產(chǎn)率低，不易測定。這時可以利用外源熒光法(也稱熒光探針法、間接測定法)進(jìn)行測量，這是利用某些熒光探劑使其與熒光較弱的或不顯熒光的物質(zhì)共價或非共價結(jié)合，以形成發(fā)熒光的絡(luò)合物再進(jìn)行測定。大部分生物物質(zhì)熒光量子產(chǎn)率很低(如蛋白質(zhì)、酶)或不發(fā)熒光(核酸)，所以利用外源熒光法才可靈敏地進(jìn)行定性和定量分析。此外，利用外源熒光法還可以研究大分子的溶液構(gòu)象。如為了研究藥物與受體、抗體與抗原、酶與輔基等重要生物活性物質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)，可測定結(jié)合時小分子或大分子的

8、熒光參數(shù)的變化。根據(jù)熒光探劑和大分子或膜結(jié)合時的熒光變化，可以探測大分子或膜的構(gòu)象，也可以了解微環(huán)境的疏水性、微粘度、化學(xué)基團(tuán)之間的距離、變構(gòu)效應(yīng)、二級結(jié)構(gòu)變化、測定二硫鍵等。因此，熒光分光光度法在分子生物學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。由于熒光分析靈敏度很高，因此對血液、尿和組織的取樣量很少。例如用一滴血就能測定血液中葡萄糖的含量。用熒光法進(jìn)行酶的定量分析，靈敏高也很高。如采用熒光法代替比色法化驗(yàn)肝功能的轉(zhuǎn)氨酶，抽血量可減為11000。甾族化合物用熒光測定的靈敏度很高，如雌酮能測到11011g，孕甾酮能測到11010g。許多藥物能用熒光法進(jìn)行分析和鑒別，如有些藥物注射劑量很小，有時低到100gL水平，用熒光法能化驗(yàn)出它自體內(nèi)的排泄量，例如阿斯匹林可測到1010g，青霉素可測到5108g，鏈霉素可測到1109g。在環(huán)境保護(hù)和衛(wèi)生防疫工作中，熒光法也得到廣泛的應(yīng)用，可用測定空氣、水源和食物的污染，其中有些是致癌物質(zhì)，例如存在于廢氣、香煙煙霧、某些水源和食物中的3，4苯并芘是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，用熒光法測定靈敏而可靠。又如發(fā)霉的花生和煙葉中的黃曲霉素也可用熒光測定。污水中一些有害的重金屬離子，也可通過間接方法測定其含量。如鉛可測到5108g，汞可測到1109g?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】： 1 陳國珍熒光分析法，北京：科學(xué)出版社，1975 2 郭堯君熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其在分子