質(zhì)粒載體基礎(chǔ)

1、第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的基本特性1質(zhì)粒的復(fù)制通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不 同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和B復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于 pMB1質(zhì)?；駽olEI質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。圖 3-1 是其復(fù)制其始示意圖。在復(fù)制時(shí)，首先合成前 RNA II，即前引物，并與 DNA形成雜交體；而后 RNase H切割前RNA I，使之成為成熟的RNA I，并形成三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)， 該引物引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。形成的 RNA I可控制RNA I形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí) Rop增強(qiáng)RN

2、A I的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。削弱RNA I和RNA I之 間相互作用的突變，將增加帶有 pMB1或（ColEI）復(fù)制子的拷貝數(shù)。-5504006001RNA1I*11圖3-1帶pMB1 （或ColEI） 復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。2質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約1幾個(gè)；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達(dá)幾百。表5-1就是不同類的質(zhì)粒與復(fù)制子及拷貝數(shù)的大致關(guān)系表3-1 :質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制子拷貝數(shù)pBR322及其衍生質(zhì)粒pMB11520pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒突變的pMB1500700pACYC及其衍生質(zhì)

3、粒p15A10 212PSC101及其衍生質(zhì)粒pSC1015ColEIColE11520pUC系列質(zhì)粒的復(fù)制單位來(lái)自質(zhì)粒 pMB1 ,但其拷貝數(shù)較高。pMB1質(zhì)粒 的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶（DNA聚合酶I , DNA聚合酶 川），依賴于 DNA的RNA聚合酶，以 及宿主基因 dnaB、 dnaC、 dnaD和danZ的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì) 合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有pMB1 （或ColEI）復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可積聚23千個(gè)質(zhì)粒。3質(zhì)粒的不相容性兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容

4、性，它是指在第二個(gè)質(zhì) 粒導(dǎo)入后，在不涉及 DNA限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用 同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè)細(xì) 胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)競(jìng)爭(zhēng)， 隨機(jī)挑選，微小的差異最終被放 大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。 而不相容群指那些具有不相容性 的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體， 一般具有相同的復(fù)制子。 在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30 多 個(gè)不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。4轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下， 很多質(zhì)粒可以通過(guò)稱為細(xì)菌接合的作用 轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動(dòng)基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因

5、tra ，順式因子 bom 及其 內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn) nic。二、標(biāo)記基因按其用途可將標(biāo)記基因分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。 選擇標(biāo)記用于鑒別 目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)，篩選標(biāo)記可 用于將特殊表型的重組子挑選出來(lái)。（一） 選擇標(biāo)記抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1氨芐青霉素抗性基因（ Ampicillin resistance genea,mpr）氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記， 絕大多數(shù)在大腸桿 菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。 青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成， 與有關(guān)的 酶結(jié)合并抑制其活性， 抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。 氨芐青霉素抗性基

6、因編碼一個(gè)酶， 該酶可 分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化&內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。青霉素是一類化合物的總稱，其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈 R-CO- 和主 核6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在6-APA中有一個(gè)飽和的噻唑環(huán)（A） 和一個(gè)B內(nèi)酰胺環(huán)，6-APA為由L-半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽2四環(huán)素抗性基因( Tetracycline resistance gentet,r)四環(huán)素可與核糖體 30S 亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。四 環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由 399 個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入 細(xì)胞。 pBR322 質(zhì)粒除了帶有氨芐青霉素抗

7、性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。 3氯霉素抗性基因（ chloramphenicol resistance genCe,mr, cat）氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。目前使用的氯霉素抗性基因來(lái)源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性 P1噬菌體（也攜帶Tn9） o cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白（每個(gè)亞基23kDa）。在乙酰輔酶 A存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合。 4卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanamycin/neomycin resistance genkea, nr, neor） 卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，

8、都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白 質(zhì)合成。卡那霉素和新霉素抗性基因?qū)嶋H就是一種編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH （3） - n , 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使這兩種抗生素磷酸化， 從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)移。 在細(xì)胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì) 腔，保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響。5琥珀突變抑制基因 supF在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA ），或琥珀突變（突變?yōu)?UAG ），或乳白突變（突變?yōu)?UGA）o supF 基因編碼細(xì)菌的抑制性 tRNA ，可在UAG密碼子上編譯酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tet

9、r基因和ampr基因，只有當(dāng)宿主含有supF基因時(shí)才會(huì)對(duì) Amp和Tet具有抗性。相應(yīng)的， supE基因在UAG密碼子上編譯谷氨酰氨。 由于目前所用的標(biāo)記基因使用方便，因此用這類標(biāo)記的載體較少。6其它還有一些正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB，來(lái)自淀粉水解芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefacie）s，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng)基上 sacB基因的表達(dá)對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重 組子。（二）篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記主要用來(lái)區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個(gè)外源 DNA 片段插

10、入 到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)， 可通過(guò)該標(biāo)記來(lái)篩選插入了外源片段的質(zhì)粒， 即重組質(zhì)粒。1. a-互補(bǔ)（ a-compleme ntatior）a互補(bǔ)是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的3半乳糖苷酶（B -galactosidase,由1024個(gè)氨基酸組成）陰性的突變 體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。a互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷3半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 3-半乳糖苷酶, 如果lacZ基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的3半乳糖苷酶。例如，lacZAM15 基因是缺失了編碼 3-半乳糖苷酶中第 11-41 個(gè)氨基酸的

11、lacZ 基因,無(wú)酶 學(xué)活性。對(duì)于只編碼 N-端140個(gè)氨基酸的lacZ基因（稱為lacZ），其產(chǎn)物 也沒(méi)有酶學(xué)活性。但這兩個(gè)無(wú)酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí),可恢復(fù)3-半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。在 lacZ 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)） ， 不影響 3-半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。但是，若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)a -互補(bǔ)能力的3半乳糖苷酶片段。利用這一 互補(bǔ)性質(zhì)， 可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。 在相應(yīng)的載體系統(tǒng) 中，lacZA M15放在F質(zhì)粒上,隨宿主傳代；lacZ放在載體上，作為篩選標(biāo)記（圖

12、3-2） 。相應(yīng)的受體菌有 JM 系列、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均帶有 D（lac- proAB）F proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 為 lac 阻抑物的 編碼基因， lacIq 突變使阻抑物產(chǎn)量增加，防止 lacZ 基因滲漏表達(dá)。lacZ基因是乳糖lac操縱子中編碼 3半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(dá)。乳糖既是lac操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基-3D-硫代半乳糖苷（IPTG ）是乳糖的衍生物，可作為lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作 為反應(yīng)的底物；5-溴4氯-3-吲哚-&D-半乳糖苷（X-ga）可作為lac操縱子的 底

13、物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物 X-gal還可充作生色劑，被 3半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色UMfe AJ| IMI葉抽亍* i kiesMF A UliMF . flJlti圖32血跡曲憶多駄的結(jié)構(gòu)關(guān)系甸通過(guò)企互補(bǔ)產(chǎn)主的崙髓色變優(yōu)市）2 插入失活通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA片段插入tetr基因后，導(dǎo)致tetr基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體克隆載體主要用于擴(kuò)

14、增或保存 DNA片段，是最簡(jiǎn)單的載體。1. pBR322圖5-3： pBR322質(zhì)粒圖諸pBR322質(zhì)粒的大小為 4361bp , Gen Ba nk注冊(cè)號(hào)為 V0III9和J01749，含 有30多個(gè)單一位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr), 其質(zhì)粒復(fù)制區(qū)來(lái)自pMB1 (如圖3-3)。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體幾乎都是 由此發(fā)展而來(lái)的。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的BamH I位點(diǎn)來(lái)插入外源DNA片段，可通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選。2. pUC18 和 pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊， 幾乎不含多余的 DNA 片段，

15、GenBank注冊(cè)號(hào)為L(zhǎng)08752 (pUC18)和X02514(pUC19)。由 pBR322 改造而來(lái)，其中 lacZ (MSC)來(lái)自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質(zhì)粒圖譜。這兩個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點(diǎn)的排列方向相反。這 些質(zhì)粒缺乏控制拷貝數(shù)的rop基因，因此其拷貝數(shù)達(dá) 500-700。pUC系列載 體含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn)a-互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過(guò)a互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。puciaGA-ATTQGCTCGGTACCCGG&GATODTCTAGAiSTgGACCT

16、GCA&SCATGCTTGGC1: I1 sal il貓闆PUC1QCaCCAAGCTTGCHGiCCTGC 心1_h4SohiHind IIIL-CAGG TCL.A L ” C TALAGGATCCL UGG JT JkCC GAGCI tiAATICSac III氏由IXta i.B#tiH I 罰川 i Kp1 XmalECOO1D9 I i26了叫Hull iflSQrAM II (2S17)PUC18/192&K bpAlwh 1(1217*耳EH I (22*4)H177)Sine rm unlWBCf(10l 177?)圖3-4 :pUC18/19質(zhì)粒圖譜3. pUC118 和

17、 pUC 119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而來(lái)，大小為 3162bp , Gen Ba nk注 冊(cè)號(hào)為 U07649(pUC118 和 U07650(pUC119)。相當(dāng)于在 pUC18/19 中增加 了帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需 的順式序列。4. pGEM-3Z/4ZPGEM-3Z/4Z由pUC18/19增加了一些功能片段改造而來(lái)，大小為 2.74kb,GenBank 注冊(cè)號(hào)為 X65304 (pGEM-3Z, 2743bp)和 X65305 (pGEM-4Z, 2746)。與pUC18/19相比，在多克隆位點(diǎn)的兩端添加了噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如Sp6和T7噬菌體的啟動(dòng)子。 pGEM-3Z和pGEM-4Z的差別在于二者互換了兩個(gè)啟動(dòng)子的位置。5多功能質(zhì)粒載體在上述載體的基礎(chǔ)上，人們?cè)O(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體， 這類質(zhì)粒載體綜合 了以上質(zhì)粒的特點(diǎn)。除了作為質(zhì)粒載體基本要素外，綜合了上述功能要素，如多 克隆位點(diǎn)、a互補(bǔ)、噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包裝信號(hào)。典型的這 類