細(xì)胞增殖凋亡粘附的測定方法

1、細(xì)胞增殖的檢測方法：四甲基偶氮唑鹽法(MTT)MTT商品名為噻唑藍(lán)， 是一種黃色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色 法，用于檢測細(xì)胞存活和增殖。其原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外 源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶-甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死 亡的細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫分析 儀測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。此方法已廣泛用于各種細(xì)胞增殖的檢測、腫瘤細(xì)胞的生長、生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以 及腫瘤放射敏感性測定4-8等

2、。此方法簡便、靈敏且無放射性。MTT溶液需要放置在4C避光保存，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。由于 MTT經(jīng)還原所 產(chǎn)生的產(chǎn)物甲瓚不溶于水，無法直接測定吸光度，需要被溶解之后才能檢測。這 不僅使工作量增加，而且 MTT溶液具有致癌性。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞的絕對數(shù)。另外，有研究發(fā) 現(xiàn)過氧化物會降低MTT測定的準(zhǔn)確度，抑制將近95%的MTT與O2 的反應(yīng)， MTT溶解產(chǎn)物甲瓚會吸附在納米纖維上，而致使檢測的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。內(nèi)鹽法(MTS)MTS是一種新型的MTT類似物。MTS在偶聯(lián)劑PMS存在的條件下，可 被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性的有色甲瓚產(chǎn)物，

3、其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)，可用酶標(biāo)儀檢測。它的優(yōu)點(diǎn)在于無放射性、 快速、安全、方便、靈活及特異性強(qiáng)，同時又克服了 MTT、XTT的缺點(diǎn)。此方 法已應(yīng)用于細(xì)胞增殖的檢測、藥物敏感性試驗、細(xì)胞毒性的檢測等，且比MTT法更加準(zhǔn)確。此方法在一定程度上也存在缺陷。最新研究表明在96孔板試驗中，靠外的 孔液體易蒸發(fā)，對檢測結(jié)果有一定影響24，且不適合于豬淋巴細(xì)胞促有絲分裂 反應(yīng)的檢測.細(xì)胞粘附能力測定：蛋白染料染色法測細(xì)胞粘附本法是以蛋白染色劑如氨基黑10B來問接測定96孔板中的細(xì)胞數(shù)目，該法迅速可 靠，還可用怍細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和染色細(xì)胞的照像。Schulz等對入角化細(xì)胞株HaCaT受其

4、亞克隆細(xì)胞株、鼠成纖維細(xì)胞林 3T,骨髓瘤細(xì)胞株x63Ag8. 653 作過這方面的研究。即用甲醛或戊二醛固定粘附細(xì)胞，吹打去除未牯附的細(xì)胞 而 粘附的細(xì)胞用pH3, 5的氨基黑染色，先用pH3. 55的鹽酸洗去附著的染料，結(jié) 合的蛋白染料可用NaOH溶解，然后在酶標(biāo)儀上讀取620rim/405或750rim處的 0D值。若用該法反映未牯附和半粘附的細(xì)胞數(shù)量，可在染色前先離心t然后固定。 該法測量表明，氨基黑的染色吸光度值與細(xì)胞數(shù)、DNA含量呈良好的線性關(guān)系，直線的回歸斜率對不同的細(xì)胞而有所不同。另外、該法可用來測定某些藥物的細(xì)胞毒作用、LAK細(xì)胞的殺傷作用以及雜交瘤抗體對細(xì)胞擴(kuò)增的生物效應(yīng)。

5、E rtt曾用氟基黑染色法來問接反映24孔板上培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)，但其操作過程比較繁瑣， 如細(xì)胞固定，染色細(xì)胞蛋白質(zhì)沉淀，多次溫育、沖洗、離心、溶解變性強(qiáng)白，最 后轉(zhuǎn)移至比色杯中進(jìn)行常規(guī)比色。 而本法只需在96孔板上即可進(jìn)行。實驗結(jié)果重 復(fù)性好，敏感性高，時間短，試劑便宜。但在測定某種細(xì)胞的粘附性時，必須先 建立其細(xì)胞數(shù)與光密度值之問的回歸曲線。因為某一特定細(xì)胞的直線回歸斜率與該種細(xì)胞的太小及其蛋白質(zhì)的含量有關(guān)。 氨基黑染色法不能區(qū)分死亡細(xì)胞與活的 細(xì)胞，但是粘附生長的細(xì)胞一旦死亡。即可自行脫離吸附的介質(zhì)，被吸出洗去。 因此，需要用cr標(biāo)記和其他物質(zhì)拆記靶細(xì)胞測定粘附的試驗太多可用該法代替。 值得注

6、意的是，死亡后仍能附著的細(xì)胞不能用氨基黑染色法測定粘附性這時可以選用中性紅、MTT以及其他臺適的染色方法。Joni曾用氨基黑染色法測定細(xì) 胞弱粘附特性 -即最小切應(yīng)力粘附 測定(MinimaSheariorce adhesion assay, MSFA)，其步驟與常規(guī)的粘附測定方法基本一致。不同之處是去除未粘附細(xì)胞時， 在液體中用輕柔的切應(yīng)力去除未粘附的細(xì)胞，這樣強(qiáng)粘附與弱粘附的細(xì)胞可同時 被測定。MSFA法去除非粘附細(xì)胞的操作方法如下：將孵育后臺粘附細(xì)胞的96孔板扳孔朝上以一定角度浸入盛有0，85 Nacl鹽液的容器中(容器中含液量約為2.5 升)然后在液體中輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)板避免板孔中形成氣泡

7、，使板孔向下板底向上， 這時可使培養(yǎng)板從液體中升至液面，容器中的鹽液用40ram長的轉(zhuǎn)子.以300rPm 的轉(zhuǎn)速室溫下攪動7分鐘這樣板孔中未桔附的細(xì)胞可技去際96孔板從NaC鹽液容器中取出時，要重新翻轉(zhuǎn)板孔向上，然后浸入含100甲醇的容器中，在甲醇 溶液中上下左右轉(zhuǎn)動96孔板使鹽波和甲醇充分混臺.切勿使細(xì)胞暴露于空氣中， 每過5分鐘重復(fù)以上動作，60分鐘后從甲醇液體中取出96孔板一去掉甲醇，染色 細(xì)胞，酶標(biāo)儀上讀取570nm OD值一牯附率的計算用以下公式：OD570粘附細(xì)胞粘附率 =X100%OD570孔中加入的總細(xì)胞用該法測得的牯附率高于常規(guī)方法的2. 5-3倍，而基礎(chǔ)的非特異性粘附率不變

8、。 結(jié)晶紫染色：他是細(xì)胞核染色常用的，用來顯示染色體的中心體，并可染淀粉、 纖維蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)等。凡是用番紅和蘇木精或其他染料染細(xì)胞核不能成功時， 用它能得到良好的結(jié)果。用番紅和結(jié)晶紫作染色體的二重染色，染色體染成紅色， 紡錘絲染成紫色，所以也是一種顯示細(xì)胞分裂的優(yōu)良染色劑。用結(jié)晶紫染纖毛，效果也很好。用結(jié)晶紫染色的切片， 缺點(diǎn)是不易長久保存。蘇木精是淡黃色到銹紫色的結(jié)晶體，易溶于酒精，微溶于水和甘油，易溶于熱水 和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。它是染細(xì)胞核的優(yōu)良材料，他能把細(xì)胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色。 分化時組織所染的顏色因處理的情況而異， 用酸性溶液（如鹽酸一酒精）分化后呈紅色

9、，水洗后仍恢復(fù)青藍(lán)色，用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍(lán)色，水洗后呈藍(lán)黑色。遇光變紅。Giemsa染色法：嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與 酸性染料伊紅 結(jié)果，染粉紅色， 稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞 胞漿為酸性，與 堿性染料美藍(lán)或天青 結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與 伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合， 染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。 m#UOkrOPH對細(xì)胞染色有影響。細(xì)胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)， 所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色 偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用正

10、經(jīng)片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞特 液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各 種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。MTT（I）接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培 養(yǎng)液配制成單個細(xì)胞懸液，以每孔103104個細(xì)胞接種于孔板中（本實驗所接種 的細(xì)胞數(shù)是每孔2x103個細(xì)胞）,每孔體積200ul,各組每個時相6孔,測量時取6孔OD 平均值。同時設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。 （2）培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板放入 COZ孵箱,在37C、5%COZ及飽和濕度條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)時間取決于實驗?zāi)康暮鸵?求)。(3)呈色:分別于1

11、天、2天、3天、4天和5天,在待測孔中每孔加入 MTT溶液 (smg/ml)20ul,37C繼續(xù)孵育4一6h,終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入 150ulDMSO,振蕩10mi n,使其充分溶解。(4)比色:選擇490nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測 儀上測定各孔光吸收值(OD值),一記錄結(jié)果。以培養(yǎng)時間為橫軸，光吸收值為縱 軸繪制細(xì)胞生長曲線。2.1細(xì)胞培養(yǎng)2.1.1細(xì)胞的復(fù)蘇(l) 細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒無菌操作配置好IOml完全細(xì)胞培養(yǎng)液并放入37C恒溫水浴箱中預(yù)溫至37C并 轉(zhuǎn)入無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)備用。從液氮中待復(fù)蘇的細(xì)胞，立即放入37C很穩(wěn)水浴箱中輕輕來回旋轉(zhuǎn)，確保細(xì)胞 凍存液在1分值

12、之內(nèi)解凍。待細(xì)胞解凍，立即用滴管吸取解凍的細(xì)胞懸液放入裝有預(yù)溫的完全細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37C、5%C02恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。2.1.2培養(yǎng)細(xì)胞換液(1) 細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒。(2) 按常規(guī)操作配制好完全細(xì)胞培養(yǎng)液并放入 37 C恒溫水浴箱中預(yù)溫備用。(3) 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出前一日復(fù)蘇的裝有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。(4) 在無菌操作臺內(nèi)用直頭吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液至廢液缸，棄吸管。(5) 取新吸管,加入無血清的不完全培養(yǎng)液，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘存的舊培養(yǎng)液沖 掉。(6) 棄去無血清的不完全培養(yǎng)液，加入事先已預(yù)溫的完全細(xì)胞培養(yǎng)液。(7) 蓋好

13、培養(yǎng)瓶的瓶蓋(稍松)，置37C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。(8) 清走所有吸管、玻璃用品等，擦拭工作臺。2.1.3細(xì)胞的凍存(1) 細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒。(2) 按常規(guī)操作無菌配制好1.Oml細(xì)胞凍存液。(3) 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出裝有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，擰緊瓶蓋,置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部70一80%面積時), 此時即可凍存。(4) 凍存細(xì)胞24小時前給細(xì)胞換液。用胰酶消化收集細(xì)胞，重懸在含有完全培養(yǎng)基中，1000印n訂min離心5分全中。 去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，留細(xì)胞沉渣。加入預(yù)先配制好的細(xì)胞凍存液(含無血清 的不完全培養(yǎng)液7份，純血清2份,

14、DMS01份)。(7) 用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，分裝入無菌凍存管中，每只凍存管內(nèi)加液Iml。旋緊 凍存管瓶蓋，做好標(biāo)記,用封口膜封住凍存管瓶身及瓶蓋。(8) 將裝有細(xì)胞的凍存管依次 4C 60分鐘一一 20E 60分鐘一一 80C過夜一液氮內(nèi) 長期凍存。2.1.4細(xì)胞的傳代(1) 吸除或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。(2) 用無血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次。(3) 向瓶內(nèi)加入Iml胰蛋白酶消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面, 然后吸掉或倒掉消化液后再加Iml新的消化液,輕輕搖動后再倒掉大部分消化液, 僅留少許進(jìn)行消化。或者不采用上述步驟，直接加1 一Zml消化液進(jìn)行消化，但要注 意盡量減少消

15、化液的剩余量。(4) 在37C或室溫25C以上環(huán)境進(jìn)行消化，消化2一5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置于倒置顯 微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。(5) 小心倒掉殘余消化液(不含EDTA)或直接加入含血清的培養(yǎng)液，終止消化。(6) 用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng) 瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。吹打時動作要輕柔，不 要用力過猛，同時盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以免對細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成 細(xì)胞懸液。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡基本原理其原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變t 2些改變包括細(xì)

16、胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變最具特征性，主要包括以下幾丨方面：1. 細(xì)胞核的改變：由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各 彳染色體熒光染料對凋 亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋 亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)門 是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之 。2. 光散射特性：凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì) 胞儀上，散射光與細(xì)胞的片小有關(guān)，而側(cè)散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作 用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射 光降低，這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的

17、特點(diǎn)之一。 此外細(xì)胞凋亡時由于染色 體降解，核破裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。細(xì)胞 壞死時，由于細(xì)胞腫脹，其前散射光增大；側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時也增大，因此 可根據(jù)前散射光和側(cè)散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，根據(jù)前 散射光和側(cè)散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性 較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中,其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細(xì)胞最 主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。也可用于活細(xì)胞的分類。

18、試劑與儀器PBS溶液；PI染液：將PI溶于PBS (pH7.4)中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4C 避光保存。70%乙醇400 目篩網(wǎng)流式細(xì)胞儀實驗步驟1. 收集細(xì)胞數(shù)目約（1 5） X106個/mL, 500 1000 r/min 離心5min，棄 去培養(yǎng)液。2. 3ml PBS 洗滌 1 次。3. 離心去PBS,加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4C, 1 2小時。4. 離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。5. 400目的篩網(wǎng)過濾1次，500 1000r/min離心5min，棄去PBS。6. 用1ml PI染液染色，4C避光30min。7. 流式細(xì)胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光,

19、激光光波波長為488nm，發(fā)射 光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光分析 PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射 光對側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。8. 結(jié)果判斷：在前散射光對側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正 常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類型有關(guān)；在分析 PI熒光的直方圖時，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞 碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在 G1/G0期前出現(xiàn)一亞 二倍體峰。如以 G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0,則一個典型的凋亡細(xì)胞 樣本其亞二倍體峰的 熒光強(qiáng)度為0.45,可用雞和鮭魚的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別 為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。注意事項細(xì)胞凋亡時，其 DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種 DNA可染性降低也可能是因為 DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變 使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。流式檢測細(xì)胞周期要點(diǎn)：最關(guān)鍵的就是減少細(xì)胞碎片和單細(xì)胞懸液的制備！1、細(xì)胞消化要理想，資料顯示