分子生物學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)

1、1,蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容,Why,How,What,USE,血漿蛋白質(zhì)組學(xué),癌蛋白質(zhì)組學(xué),修飾蛋白質(zhì)組學(xué),定量蛋白質(zhì)組學(xué),結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué),功能蛋白質(zhì)組學(xué),亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué),藥物蛋白質(zhì)組學(xué),毒理蛋白質(zhì)組學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,2,蛋白質(zhì)組學(xué),3,蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生,蛋白質(zhì)組的研究方法,蛋白質(zhì)組研究的內(nèi)容,Why,How,What,Use,why proteins? why omics?,蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,4,Why?,We just know the INFORMATION.,2004年，國際人類基因組組織正式宣布人類基因組計劃

2、完滿結(jié)束，辨認(rèn)了大約3.2萬個基因（32億個堿基對）。,除了已經(jīng)知道有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因以外，其余的基因只是計算出的 可讀框 （Open Reading Frame）,基因組的ORF準(zhǔn)確數(shù)目確定困難 ORF是否與蛋白質(zhì)有一一對應(yīng)關(guān)系也不能肯定 擬基因pseudogene、RNA編輯、蛋白質(zhì)剪切,5,Why?,基因功能的注釋依賴于對蛋白質(zhì)的認(rèn)識,We must know the PROTEINS.,蛋白質(zhì)存在形式和活動規(guī)律依賴于直接對蛋白質(zhì)的研究,蛋白質(zhì)是生命的組成者和生命活動的執(zhí)行者,6,Assumption,如果把人類252種細(xì)胞中的蛋白質(zhì)全部鑒定出來則可以真正知道人類基因組的所有基因。,7,

3、Why?,生命現(xiàn)象涉及到 多個蛋白質(zhì)，多個蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，在執(zhí)行生理功能時蛋白質(zhì)的表現(xiàn)為多樣和動態(tài) 。,生物學(xué)研究的最終目標(biāo)是了解生物系統(tǒng)的所有組分和運(yùn)行機(jī)制及系統(tǒng)水平的協(xié)同行為.,蛋白質(zhì)所表達(dá)功能只有在同一細(xì)胞內(nèi)其它蛋白質(zhì)的功能和活性同時表達(dá)才有意義.,8,氨基酸數(shù)量多于核苷酸 蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多樣 復(fù)雜的修飾方式 蛋白質(zhì)數(shù)量難以估計 沒有類似于PCR和分子雜交的技術(shù),蛋白質(zhì)研究的難度大于DNA研究,從DNA到蛋白質(zhì)：復(fù)雜性增加、高度動態(tài)、彼此作用，由此更增加了研究難度,consider the cell as a collection of PROTEIN MACHINES,9,

4、Why?,What an awful number!,10,The World of Omics,GENOMICS,METABONOMICS,TRANSCRIPTOMICS,PEPTIDEOMICS,GLYCOMICS,PROTEOMICS,11,Why?,微陣列技術(shù)帶來的是思考方式的改變宏觀,生物信息學(xué),表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），蛋白序列數(shù)據(jù)庫的發(fā)展,We have some SPECIFIC TOOLS,TECHNICIAL SUPPORT,but not enough,生物質(zhì)譜儀,軟件,12,蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué),13,Assumption,如果把人類252種細(xì)胞中的蛋白質(zhì)全部鑒定出來則

5、可以真正知道人類基因組的所有基因。,蛋白質(zhì)組是以基因組擁有的所有基因表達(dá)產(chǎn)物來構(gòu)成。,循環(huán)定義,要找出一個生物體基因組的全部基因和相應(yīng)的全部蛋白質(zhì)是一個非常困難的任務(wù)。,14,GENOMICS,TRANSCRIPTOMICS,PROTEOMICS,反向蛋白質(zhì)組學(xué) reverse proteomics,蛋白質(zhì)組學(xué) proteomics,信息、數(shù)據(jù)、技術(shù)相互依賴和支持。,15,蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生,蛋白質(zhì)組的研究方法,蛋白質(zhì)組研究的內(nèi)容,Why,How,What,Use,修飾蛋白質(zhì)組學(xué),定量蛋白質(zhì)組學(xué),結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué),功能蛋白質(zhì)組學(xué),亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,16,蛋白質(zhì)組概

6、念于1994年由澳大利亞Macquaie 大學(xué)的Wilkins和Williams首次提出，定義為: 蛋白質(zhì)組指的是一個基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) PROTEOME 是由蛋白質(zhì)的 PROTE 和 基因組的 OME 字母拼接而成,What?,17,蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics） 以蛋白質(zhì)組為研究對象，大規(guī)模、系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)的特征及結(jié)構(gòu)，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾及其相互作用等。,蛋白質(zhì)組 （proteome） 一個基因組、一種生物和一種細(xì)胞/組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。,What?,在基因組水平上分析蛋白質(zhì)的 生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞學(xué)定位。,特殊的方法學(xué),18,功能蛋白質(zhì)組學(xué)（表達(dá)蛋白質(zhì)

7、組學(xué)） （functional proteomics） 定性定量研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞增殖、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等特定狀態(tài)下表達(dá)的變化的蛋白質(zhì)組學(xué)。 它主要比較在不同生長狀態(tài)下或病理情況下同一種細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)組內(nèi)的差異蛋白質(zhì)。.,Functional Proteomics, the comprehensive analysis of proteins with special attention to their functions, is a powerful and useful approach for investigations in the life and medical science

8、s.,19,結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué) （structural proteomics） 在原子水平上闡明生物體的全部生物大分子的結(jié)構(gòu)特性。,結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)的兩個目標(biāo)： 測定一些經(jīng)過認(rèn)真選擇可能代表所有的折疊類型的蛋白，其它蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以通過計算機(jī)技術(shù)模擬出來，這對分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征在系統(tǒng)發(fā)生上的分布有重要價值； 測定相當(dāng)數(shù)量的來自模式生物的蛋白表達(dá)譜或疾病相關(guān)的蛋白表達(dá)譜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為闡明生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能提供資料。,20,修飾蛋白質(zhì)組學(xué) （modification-specific proteomics） 細(xì)胞內(nèi)的大部分蛋白質(zhì)通常都被進(jìn)行過翻譯后修飾，主要有磷酸化、糖基化等。修飾過的蛋白質(zhì)具有其

9、特定的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能，因此對蛋白質(zhì)修飾的研究構(gòu)成了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要部分，由此而產(chǎn)生蛋白質(zhì)組學(xué)的新概念。 如果把一個修飾蛋白視為一種新的蛋白，那么蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)數(shù)量將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相應(yīng)的基因組的基因數(shù)量，據(jù)此估計人類蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)種類為20200萬。,Phosphoproteomics 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué) Glycoproteomics 糖蛋白質(zhì)組學(xué),21,不同的蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞的不同部位，其功能與其空間定位密切相關(guān)，許多蛋白質(zhì)常常通過在不同的亞細(xì)胞環(huán)境中的運(yùn)動而發(fā)揮作用。細(xì)胞器、多蛋白質(zhì)組成的功能單位的區(qū)域化分布和聚集可被看作是蛋白質(zhì)除等電點(diǎn)、相對分子質(zhì)量之外的第三向分離參數(shù),亞

10、細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué),（subcellular proteomics）,降低復(fù)雜度 低豐度蛋白相對富集 部分提示蛋白定位和功能信息,亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離,定位的真實性（污染？）,22,相互作用組的研究可以分為兩類 一類是研究蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞內(nèi)的許多活動如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等都是通過一個復(fù)雜而廣泛的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)的； 另一類是研究蛋白質(zhì)復(fù)合體的組成, 蛋白質(zhì)復(fù)合體通?？梢苑譃?種，一種是 結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)復(fù)合體，如核孔復(fù)合體，通常比較穩(wěn)定；另一種則是 功能型蛋白質(zhì)復(fù)合體，如負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體和負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的復(fù)制蛋白復(fù)合體，這類復(fù)合體只有在執(zhí)行功能時才聚合在一起，很不穩(wěn)定。,相互作用組,（in

11、teractome）,23,對一個基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和精確定量的科學(xué)。 細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的豐度并不單單在轉(zhuǎn)錄水平上被調(diào)控，還在翻譯水平和翻譯后修飾的水平被調(diào)控，因而不能通過檢測體內(nèi)的mRNA的豐度來間接進(jìn)行準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量。,Differential staining Isotope coded affinity tags (ICAT),定量蛋白質(zhì)組學(xué),（quantitative proteomics）,直接對蛋白質(zhì)定量,24,蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生,蛋白質(zhì)組的研究方法,蛋白質(zhì)組研究的內(nèi)容,Why,How,What,Use,蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,25,各類蛋白質(zhì)樣品制備技術(shù),

12、蛋白質(zhì)分離技術(shù),蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),蛋白質(zhì)組研究的定量方法,蛋白質(zhì)組研究技術(shù)概述,How?,從細(xì)胞/組織/體液等進(jìn)行蛋白樣品全息制備,對混合蛋白樣品獲得最佳分離效果 電泳、色譜,對分離的蛋白進(jìn)行鑒定 圖像分析技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)(鑒定原理）,對分離的蛋白進(jìn)行定量鑒定 ,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)及面臨的技術(shù)挑戰(zhàn),26,蛋白質(zhì)組研究技術(shù)概述,蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾 及其相互作用,雙向凝膠電泳-質(zhì)譜 多維色譜-質(zhì)譜,磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué) 糖蛋白質(zhì)組學(xué),生物化學(xué)方法 遺傳學(xué)方法 生物信息學(xué)方法,表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué),功能蛋白質(zhì)組學(xué),定量蛋白質(zhì)組學(xué),27,蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué),大規(guī)模的蛋白質(zhì) 分離、識別、

13、鑒定技術(shù),雙向凝膠電泳-質(zhì)譜 多維色譜-質(zhì)譜,28,二、二維電泳和質(zhì)譜是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的常規(guī)技術(shù),二維凝膠電泳（2-DE）技術(shù)、質(zhì)譜（MS）技術(shù)以及大規(guī)模數(shù)據(jù)處理仍然是蛋白質(zhì)組學(xué)的三大基本支撐技術(shù)。,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)路線有兩條：, 以2-DE分離為核心的研究路線：混合蛋白首先通過2-DE分離，然后進(jìn)行膠內(nèi)酶解，再用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。 以色譜分離為核心的技術(shù)路線：混合蛋白先進(jìn)行酶解，經(jīng)色譜或多維色譜分離后，對肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析以實現(xiàn)蛋白的鑒定。,29,（一）二維電泳是分離蛋白質(zhì)組的有效方法,2-DE是分離蛋白質(zhì)組最基本的工具，其原理是蛋白質(zhì)在高壓電場作用下先進(jìn)行等電聚焦（isoelectr

14、ic focusing，IEF）電泳，利用蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同使蛋白質(zhì)得以分離；隨后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），按蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行分離。,30,蛋白質(zhì)的二維電泳,31,（二）質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組鑒定的重要工具,1用肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定蛋白質(zhì),2用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的分子質(zhì)量，形成一個特異的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），通過數(shù)據(jù)庫搜索與比對，便可確定待分析蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。,用PMF方法不能鑒定的蛋白質(zhì)可通過質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）信息并通過數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定該蛋白質(zhì)。,32,蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析,33,蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生,蛋白質(zhì)組的研究方法,蛋白質(zhì)組研究的內(nèi)容,蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,Why,How,What,USE,血漿蛋白質(zhì)組學(xué),癌蛋白質(zhì)組學(xué),藥物蛋白質(zhì)組學(xué),毒理蛋白質(zhì)組學(xué),亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué),34,毒理蛋白質(zhì)組學(xué),從蛋白質(zhì)角度研究外源性物質(zhì)對生命有機(jī)體的毒害作用機(jī)制；篩選特