蛋白質基礎及檢測技術ppt課件

1、蛋白質基礎及檢測技術,1 蛋白質的基本概念,蛋白質（protein）是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位,蛋白質不僅在功能上與糖、脂肪不同，在元素組成上亦有差別。 根據(jù)蛋白質的元素分析表明，其元素組成依次為：碳(50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19%）、氫（6-7%）硫（0-4%）。有的還含有少量磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘等元素。一切蛋白質皆含有氮并且大多數(shù)蛋白質含氮量比較接近而恒定，一般為1517，平均為16。這是蛋白質元素組成的一個重要特點，也是各種定氮法測定蛋白質含量的計算基礎

2、。即用定氮法測得的含氮量乘以625，即可算出樣品中蛋白質的含量。但有的蛋白質中氮的含量有一定差別，應根據(jù)其氮的真實含量進行計算,2 蛋白質的元素組成,3.1 氨基酸的結構 自然界的氨基酸超過300種，但是組成人體蛋白質的氨基酸有20種，可以看作是羧酸分子中-碳原子上的氫原子被氨基取代而成的化合物，均屬于-氨基酸，即其氨基和羧基都連接在-碳原子上。 氨基酸碳鏈表示： 其結構可用下列通式表示,注：R代表不同的側鏈基團，R不同代表不同的氨基酸,3 蛋白質結構的基本單位氨基酸,各種氨基酸在結構上有下列共同特點： 組成蛋白質的氨基酸皆為-氨基酸。 不同的-氨基酸，其R側鏈不同（氨基酸分類的依據(jù)）。它對蛋

3、白質的空間結構和理化性質有重要的影響。 除R側鏈為氫原子的甘氨酸外，其它氨基酸的-碳原子所連接的四個原子或基團互不相同，該碳原子都是不對稱碳原子。 20種氨基酸中的脯氨酸含有亞氨基，所以它是亞氨基酸。半胱氨酸在蛋白質分子中多數(shù)是以胱氨酸的形式存在,3.2 氨基酸的分類 根據(jù)側鏈R基團的結構和性質進行分類： 1）酸性氨基酸谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp 其R基團含羧基，在pH7時，羧基可解離而使分子帶負電荷。游離或在蛋白質中都帶負電荷，以酸根形式存在。在蛋白質中與正電基團形成鹽鍵。 2）堿性氨基酸賴氨酸Lys、精氨酸Arg和組氨酸His 其R基團含堿性基團，在pH7時，這些基團可質子化而使分子帶正

4、電荷。 3）非極性疏水性氨基酸 其R基團無極性、不解離，且為疏水性的。 4）不解離的極性氨基酸（極性非電離氨基酸）羥基氨基酸+巰基氨基酸+甘氨酸 其R基團雖有極性但不能解離。 5）蛋白質中少見的氨基酸無遺傳密碼，來自翻譯后加工修飾,3.3 氨基酸的理化性質 3.3.1 兩性解離及其等電點 氨基酸是兩性電解質： 氨基酸既含羧基,又含氨基,同時能起酸和堿的作用，是兩性電解質，在水溶液中主要以兼性離子（偶極離子）的形式存在。 氨基酸的等電點： 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陰、陽離子的趨勢和程度相等而成為兼性離子，呈電中性時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點（isoelectric point，pI,

5、3.3.2 紫外吸收性質 20種氨基酸在可見光區(qū)無吸收。在遠紫外區(qū)：220nm都有光吸收。在近紫外光區(qū)（220-300nm）只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收；色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰都在280nm附近。 由于大多數(shù)蛋白質中含有色氨酸和酪氨酸殘基，所以可以測定蛋白質溶液的280nm的光吸收值對蛋白質進行定量分析。 3.3.3 茚三酮反應 氨基酸與茚三酮水合物共熱生成藍紫色化合物，在570nm處有最大吸收峰，可以作為定量測定氨基酸的方法,4.1 肽鍵 一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合形成的共價鍵（-CONH-）稱為肽鍵，又稱酰胺鍵。蛋白質分子中的氨基酸通過肽鍵連接,4 肽,4.

6、2 肽 氨基酸通過肽鍵連接起來的化合物稱為肽,4.3 氨基酸殘基（residue） 氨基酸在形成肽鏈后，因有部分基團參加肽鍵的形成，已經不是完整的氨基酸，故將蛋白質肽鏈中的每個氨基酸部分稱為氨基酸殘基。 每一個氨基酸殘基上都有一個R側鏈，不同R側鏈有不同的性質和功能。 多肽鏈有兩端： 具有游離-氨基的稱為氨基末端（N-末端，amino terminal），通常寫在肽鏈的左端。 具有游離-羧基的稱為羧基末端（C-末端，carboxyl terminal），常寫在肽鏈的右端。 多肽鏈的方向從N-端到C-端，肽鏈也是從N-端到C-端按氨基酸殘基的順序來命名的,N端測序 幾乎所有的蛋白合成都起始于N-

7、端，蛋白質N-端的序列組成對于蛋白質整體的生物學功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質的半衰期，同時關聯(lián)著蛋白亞細胞器定位等，這些與蛋白的功能和穩(wěn)定性息息相關，對蛋白進行N-端測序分析，有利于幫助分析蛋白質的高級結構，揭示蛋白質的生物學功能。 方法： 目前對蛋白N端測序主要分類兩大類，其一為非質譜技術，例如經典的Edman降解法、利用反轉錄RT-PCR得到對應蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列；其二為質譜技術。各自都有其使用的長處和制約之處，目前，市面上采用的，依然是基于經典的Edman降解法原理，利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統(tǒng)進行蛋白N-端測序。 原理：Ed

8、man化學降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質和多肽的N-端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解，和噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三個主要的化學步驟，每個循環(huán)從蛋白質與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個Edman降解，最后通過轉移的PTH-氨基酸鑒定實現(xiàn)蛋白質序列的測定,C端測序 眾所周知，C端序列是蛋白質和多肽的重要結構與功能部位，對蛋白質的生物功能甚至起決定性作用。此外，由于蛋白翻譯后在細胞內需要進一步剪切和修飾，通常不能簡單的使用基因序列對C-端或N端做簡單的預測，對于蛋白生物制品來說，使用C-端測序必不可少，

9、隨著蛋白質組學研究的不斷深入，蛋白質C端測序對其功能研究將發(fā)揮越來越重要的作用。一些新的蛋白質C端測序方法已建立，提高了靈敏度和重復性，能夠在蛋白質組水平應用。 方法：羧肽酶法、化學法及串聯(lián)質譜法。 目前，使用較多的是利用串聯(lián)質譜法，其原理為利用蛋白質在質譜中有規(guī)律的破碎，獲得蛋白質肽段的碎片，分析圖譜得到蛋白質的C-端序列,5.1 穩(wěn)定蛋白質的作用力 蛋白質是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接起來的，具有特定分子結構的高分子化合物。蛋白質的分子結構可人為劃分為一、二、三、四級結構。除一級結構外，蛋白質的二、三、四級結構均屬于空間結構，即構象。蛋白質的構象通常由非共價鍵（次級鍵）來維系,5 蛋白質的

10、三維結構,5.2 蛋白質的結構 蛋白質分子內各個原子之間相互的立體關系就是蛋白質分子的結構。通常將蛋白質的結構分為一級結構、二級結構、三級結構和四級結構。 5.2.1 蛋白質的一級結構 蛋白質的一級結構：又稱為初級結構或化學結構,是指蛋白質分子中,由肽鍵連接起來的各種氨基酸的排列順序。每種蛋白質都有唯一而確切的氨基酸序列。 一級結構的主要化學鍵是肽鍵，有些還包括二硫鍵（-S-S-）。因共價鍵的鍵能大，故蛋白質的一級結構穩(wěn)定性較強,蛋白質的一級結構包括： 組成蛋白質的多肽鏈數(shù)目； 多肽鏈的氨基酸順序； 多肽鏈內和鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎

11、。 測定蛋白質一級結構的主要意義： 一級結構是研究高級結構的基礎； 可以從分子水平闡明蛋白質的結構和功能的關系； 可為生物進化提供理論依據(jù)； 可為人工合成蛋白質提供序列參考。 目前可以運用氨基酸自動分析儀和質譜對蛋白質的一級結構進行測定,氨基酸序列分析一般采用綜合的方法測定目標制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進行比較。 自動序列分析儀測序 其原理為Edman降解法，分為耦合、切割、萃取、轉化、鑒定等幾個步驟。首先在pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(PhN=C=S，PITC)和蛋白質或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合

12、后產物，將多肽或蛋白的N一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強酸性條件下轉化為穩(wěn)定的乙內酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色譜法鑒定出降解下來的PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質或多肽N端序列信息,質譜技術 質譜所使用的測序方法是denovo測序, 是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產生的一系列的有規(guī)律的片段離子之間的質量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處的y離子和b離子來推測氨基酸序列從而不受翻譯后修飾和純度的限制，但是質譜測序是有局限性的，1. 質譜測序依賴于公共數(shù)據(jù)庫。 如果所研究的物種的基因組沒有完全被測序，或者其中

13、部分沒有對應的序列， 那么質譜測序將無法得出正確的鑒定。2. 我們使用的搜索引擎的打分和算法可能也會使得我們遺漏一部分的肽段和質譜圖的匹配， 產生假陽性結果。3. 如果有點突變或者未知修飾存在的話， 由于搜庫算法或者參數(shù)設置中沒有考慮到， 同樣也無法得出正確的結果。 質譜技術還廣泛用于蛋白質的純度鑒定、分子質量測定、肽(質)譜分析、二硫鍵、乙?；⑻腔?、磷?；约胺枪矁r結合等,5.2.2 蛋白質的二級結構 蛋白質的二級結構：是指蛋白質分子中多肽鏈本身的折疊方式。形成蛋白質二級結構基礎的是肽單元或肽鍵平面。 蛋白質的二級結構主要依靠氫鍵來維持結構的穩(wěn)定性。 常見的二級結構元件： -螺旋 -折

14、疊 -轉角 -凸起 無規(guī)則卷曲,鑒定方法：常用圓二色譜法(Circular dichroism,CD,圓二色譜法 圓二色光譜儀通過測量生物大分子的圓二色光譜從而得到生物大分子的二級結構。當平面偏振光通過具有旋光活性的介質時，由于介質中同一種旋光活性分子存在手性不同的兩種構型，故它們對平面偏振光所分解成的右旋和左旋圓偏振光吸收不同，從而產生圓二色性。遠紫外的圓二色譜可用來測定蛋白質的二級結構，近紫外的圓二色譜可用來檢測蛋白質側鏈的三級結構。 應用： 蛋白質折疊、蛋白質構象研究，DNA/RNA反應，酶動力學，光學活性物質純度測量，藥物定量分析。天然有機化學與立體有機化學，物理化學，生物化學與宏觀大

15、分子，金屬絡合物，聚合物化學等相關的科學研究,5.2.3 蛋白質的三級結構 蛋白質的三級結構：是指具有二級結構的肽鏈,按照一定方式再進一步卷曲、盤繞、折疊成一種看來很不規(guī)則,而實際上有一定規(guī)律性的三維空間結構。 維系三級結構的化學鍵主要是非共價鍵（次級鍵），如疏水作用、氫鍵、鹽鍵、范氏引力等，但也有共價鍵，如二硫鍵等,5.2.4 蛋白質的四級結構 蛋白質的四級結構：具有三級結構的蛋白質分子,通過一些非共價鍵結合起來,而成為具有生物功能的蛋白質大分子,就是蛋白質的四級結構。 亞基：是指參與構成蛋白質四級結構的、每條具有三級結構的多肽鏈。亞基雖然具有二、三級結構,但是在單獨存在時并沒有生物活力,只

16、有完整的四級結構才具有生物活力。 維系蛋白質四級結構的是氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水作用等非共價鍵,血紅蛋白空間結構,蛋白質高級結構的實驗解析方法,蛋白質結構實驗分析主要有 三大技術平臺,1）X-衍射蛋白質晶體結構分析 （2）核磁共振波譜分析 （3）冷凍電鏡技術,蛋白質晶體結構X-衍射分析,摸索蛋白質結晶條件、快速處理晶體結構數(shù)據(jù)和減少差錯是目前蛋白質晶體結構分析的兩大難題或瓶頸,是目前分辨率最高的結構測定方法，高通量晶體結構分析中的幾大重要環(huán)節(jié)是：數(shù)據(jù)處理與分析、重原子的定位、密度修飾、分子替換、圖形整合、模型加工和確認,晶體結構分析的常用軟件有SOLVE，RESOLVE等,核磁共振波譜分析,

17、利用核磁共振原理，檢測分子質量小于60k的蛋白質，通過對其核磁共振譜線特征參數(shù)的測定來分析蛋白質的結構與性質，就是將原始資料利用傅里葉變換轉換為不同的峰值，然后采集各種不同的峰組成圖譜，并利用生物信息學方法篩選出具有特定結構特征的圖譜。 常用NMRPipe和SPARKY軟件處理這些過程，使用XEASY，DYANA和GARANT等軟件分析側鏈或骨架結構,冷凍電子顯微鏡技術,采用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態(tài)的水環(huán)境中，使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態(tài)下的結構；同時冷凍的速度極快，把細胞在其生理活動的某些特定時刻固定下來，顯示此時的結構特點，進而可通過不同功能狀態(tài)的瞬時構象變化來研究生

18、物分子的功能。冷凍電鏡獲得的是處于天然狀態(tài)下未經染色的分子的二維投影像。將樣品進行不同角度的傾斜所獲得的數(shù)據(jù)進行綜合分析，并依據(jù)樣品的不同特性使用不同的重構技術獲得分子的結構，在此基礎上觀察多種成分的圖像變化，追蹤生物大分子的裝配及其動力學過程,蛋白質結構的可視化,可視化分析蛋白質的高級結構，有利于從原子間相互作用的層次理解生命活動過程的信息控制機制，更加有效地揭示分子在完成其功能過程中的演化情況，了解蛋白質分子結構和各種微觀性質與宏觀性質之間的定量關系。只要安裝蛋白質分子圖形學軟件，并獲得所需蛋白質結構數(shù)據(jù)，配以商業(yè)軟件或免費的小分子圖形設計系統(tǒng)，就可開展結構生物信息學的探索性工作,6.1

19、兩性和等電點 蛋白質是由-氨基酸通過肽鍵構成的高分子化合物，在蛋白質分子中存在著氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白質也是兩性物質。 等電點（isoe1ectric point，pI）：當?shù)鞍踪|處于某一pH值的溶液中時，蛋白質分子上所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，蛋白質為兼性離子，此時溶液的pH值稱為該蛋白質的等電點（isoe1ectric point，pI）。等電點是蛋白質的特征常數(shù)，各種蛋白質有各自的等電點。 當?shù)鞍踪|所處環(huán)境的pH大于pI（等電點）時，蛋白質分子帶負電荷，pH小于pI時，蛋白質帶正電荷，pH等于pI時，蛋白質所帶凈電荷為零，此時溶解度最小。 等電點檢測方法：毛細管電泳法，

20、等點聚焦電泳,6 蛋白質的理化性質,6.2 水解反應 蛋白質在酸、堿或酶的作用下發(fā)生水解反應，經過多肽，最后得到多種-氨基酸。蛋白質水解時，應找準結構中鍵的“斷裂點”，水解時肽鍵部分或全部斷裂。 舉例：Edman降解法測定蛋白質的氨基酸順序，但該法一次只能降解幾十個氨基酸殘基，因此利用蛋白質的水解性質將蛋白質水解為一些小肽段，分別進行測序，最后進行拼接，獲得蛋白質的氨基酸順序。 6.3 膠體性質 有些蛋白質能夠溶解在水里（例如雞蛋白能溶解在水里）形成溶液。蛋白質的分子直徑（1-100nm）達到了膠體微粒的大小，所以蛋白質具有膠體的性質。 在蛋白質表面有親水基團，能與水發(fā)生水合作用，水分子受蛋白

21、質極性基團的影響，定向排列在蛋白質分子的周圍，形成水化層，將蛋白質顆粒分開，不致相聚而沉淀。 蛋白質在偏離等電點的溶液中，形成電荷層，同性電荷相斥，防止蛋白質顆粒相聚沉淀,6.4 沉淀 原因：加入高濃度的中性鹽、加入有機溶劑、加入重金屬、加入生物堿或酸類、熱變性。 鹽析：向蛋白質水溶液中加入濃的無機鹽溶液，可使蛋白質的溶解度降低，而從溶液中析出，這種作用叫做鹽析。 鹽析出的蛋白質仍舊可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質的性質，因此鹽析是個可逆過程。利用這個性質，采用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質 不同的蛋白質其性質不同，耐受酸、堿、鹽、重金屬等的程度也不同 ，因此我們再對純化工藝獲得的蛋白質進行

22、檢測時應充分了解該蛋白質的相關性質及緩沖成分，保證檢測任務順利進行,6.5 變性 蛋白質的變性：是指蛋白質在某些理化因素影響下，其特定空間結構破壞而導致理化性質改變和生物學活性喪失的現(xiàn)象。 蛋白質變性的物理因素有：高溫、高壓、超聲波、紫外線、X射線等。 蛋白質變性的化學因素有：強酸、強堿、濃乙醇、重金屬、尿素、去污劑等。 蛋白質變性的本質：蛋白質變性只破壞二硫鍵和次級鍵，而不涉及肽鍵的斷裂，因此一級結構并未破壞。 蛋白質變性后性質的改變：溶解度降低、粘度增加、結晶能力消失、生物活性喪失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。 Gly-SDS-PAGE: 還原性-SDS-PAGE：還原劑為DTT或巰基乙醇

23、，樣品需煮沸，高級結構破壞，一級結構未被破壞。 非還原性SDS-PAGE(不含還原劑，但含有SDS)，樣品不需煮沸，檢測 蛋白質是否存在二硫鍵或多聚體，也可簡單判斷蛋白質是否復性成功。 Native -PAGE：是在不加入SDS、巰基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰氨凝膠電泳。在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性和構像。 為什么蛋白質純度檢測用非還原性電泳,應用： 如在臨床上用高溫、高壓、紫外線、75%酒精消毒就是利用了這些變性因素使細菌、病毒的蛋白質變性，從而失去致病作用。 在蛋白質的制備過程中，如果提取的目的蛋白是熱穩(wěn)定的，可利用熱變形的方法很方便的除去

24、其它雜蛋白。而對于不利的變性則應該盡量避免,蛋白質的復性：是指有些蛋白質變性后，如果設法將變性因 素除去，該變性蛋白質尚能恢復其空間結構與活性。 利用蛋白質的復性特征可對包涵體蛋白質進行變性-復性純化。 例如在包涵體蛋白質純化過程中常用尿素或鹽酸胍對包涵體進 行溶解，純化獲得目的蛋白后，再通過透析除去變性劑(尿素、 鹽酸胍、-巰基乙醇等)，或通過稀釋減少變性劑的含量，則其 特定的氨基酸順序重新卷曲、折疊成原來的天然構象，酶的活 性也恢復到原來的水平。 檢測復性成功的方法： 非還原性電泳、生物活性檢測、結構確認,6.6呈色反應 蛋白質分子中，肽鍵及某些氨基酸殘基的化學基團，可與某些化學試劑反應顯

25、色，稱為蛋白質的呈色反應。利用這些呈色反應可以對蛋白質進行定性和定量分析。 6.7 蛋白質的紫外吸收性質 這要來自酪氨酸和色氨酸對于280nm紫外光的吸收，可以對蛋白質進行定性和定量分析,蛋白質分析鑒定是蛋白質研究中的一個最基本技術，是確定蛋白質產品的是與非的問題，尤其是在研究新的蛋白質組分時顯得更重要。研究一個新的蛋白質首先要從它的基本性質作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質進行分離純化，最終用純品對其進行分析鑒定。如果對蛋白質的基本性質尚未搞清楚，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質研究技術首先要對蛋白質的基本性質的進行分析鑒定。 蛋白質分子是非常復雜的生物大分子,能代表其特征參數(shù)很多。但在普通

26、實驗室能夠進行測定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下幾種： 蛋白質的質量鑒定(分子量) 蛋白質帶電性鑒定(等電點) 蛋白質結構鑒定(一二級結構、晶體結構、肽譜、N和C-末端) 蛋白質生物學功能鑒定(生物活性、比活、酶促動力學) 免疫學鑒定(抗原-抗體反應、酶聯(lián)免疫反應,7 蛋白質的表征,7.1 蛋白質的純化 蛋白質的分離純化是研究蛋白質的基礎和起點。蛋白質的來源是多樣的，主要來自動物、植物的各種組織和微生物，取材要采用含量豐富的器官。抽提蛋白質的第一步是將組織粉碎，破壞細胞，以便于抽提出蛋白質；第二步就是對抽提出來的蛋白質進行純化。 7.1.1 幾種常見的細胞破碎方法 (1)機械方法 1)搗碎發(fā)；2)研磨法；3)勻漿法 (2)物理方法 1)溫差法；2)壓差法 (3)生物化學方法 1)采用化學試劑甲苯、丙酮、氯仿、Triton等通過化學滲透使細胞內含物選擇性的滲透出來；2)自溶法；3)酶解法,7.1.2 蛋白質的純化方法 7.1.2.1將多組分蛋白質變?yōu)閱我唤M分蛋白質 根據(jù)蛋白質的分子形狀和分子質量大小、電離性質、溶解度和疏水性、生物功能專一性等，常用有各種鹽析法、超離心沉降、結晶、電泳、凝膠過濾，離子交換層析、親和層析、疏水層析等。近年來發(fā)展的FPL