病毒感染的檢查方法

1、病毒感染的檢查方法,一、標(biāo)本采集與送檢,原則： 1.盡早采?。喊l(fā)病初期 2.部位適宜：由感染部位采取 3.冷藏速送：裝有冰塊或干冰的容器內(nèi),一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本,二）檢測特異性抗體 的標(biāo)本 采集雙份血清，4-20保存,病毒分離是診斷病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，一旦陽性，即可確診。 不適用于快速診斷，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本高，陽性檢出率低等 有時(shí)不得不分離病毒，例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病，必須分離病毒進(jìn)行研究，或者分離株的鑒定對(duì)流行病學(xué)有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望獲得天然弱毒株等,二、常規(guī)分離與鑒定,一）病毒分離,二）病毒鑒定,1. 形態(tài)學(xué)鑒定,觀察CPE。常見的細(xì)胞形態(tài)

2、學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體,正常細(xì)胞,病變細(xì)胞,感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的能力 感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細(xì)胞的作用,2. 血吸附和血凝作用,多見于以出芽方式釋放的病毒,紅細(xì)胞吸附,正常細(xì)胞,1）血吸附作用,吸附試驗(yàn)可通過特異抗血清抑制來達(dá)到鑒定具有吸附特性的病毒,2）血凝作用,血凝試驗(yàn),血凝抑制試驗(yàn),3）病毒成分的直接檢測,用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)直接檢查感染細(xì)胞或其上清液中病毒抗原（或核酸,三、 電子顯微鏡檢查,病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織

3、或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子,透射電子顯微鏡,1. 正染法：超薄切片法,雞痘病毒（超薄切片,超薄切片法的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程 缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長時(shí)間保存,2.負(fù)染技術(shù),負(fù)染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小,銅網(wǎng),樣品,濾紙,染液（常用磷鎢酸,1-2分鐘后電鏡觀察,口蹄疫病毒的電鏡負(fù)染,負(fù)染法的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：快速簡易（10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu) 缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài),免疫電鏡技

4、術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法,3.免疫電鏡技術(shù)(Immune electron microscopy，IEM,1）免疫凝集電鏡技術(shù),抗原與抗體凝集反應(yīng)后，可使標(biāo)本中病毒顆粒聚集成團(tuán)，再經(jīng)負(fù)染直接在電鏡下觀察，提高了敏感性，確定病毒的血清學(xué)性質(zhì),2）免疫電鏡定位技術(shù),特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、過氧化物酶等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位,酶標(biāo)記染色,四、 血清學(xué)試驗(yàn),是一種常用的診斷病毒病的方法?？刹捎肊LISA、瓊脂擴(kuò)散、中和

5、試驗(yàn)、標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原,virus,1.中和反應(yīng),觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體,2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng),溶血 （,不溶血 （,3.免疫擴(kuò)散,4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA,將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測定,1）間接ELISA,2）夾心ELISA,五、分子生物學(xué)技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng) （PCR,2. 核酸雜交技術(shù),核酸探針（probe）是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段，可檢測待檢樣品中特定的基因順序,六、 感染組織的組織學(xué)檢查,病毒在光學(xué)顯微鏡下無法看到，但是在某些病毒感染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，或者細(xì)胞形態(tài)發(fā)生