2017 2018高中生物第四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐第10課時(shí)分子生物學(xué)技術(shù)同步備課蘇教選修11

1、第,10,課時(shí),分子生物學(xué)技術(shù),章,生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐,學(xué)習(xí)導(dǎo)航,1,結(jié)合教材了解,PCR,技術(shù)的基本操作,2,理解,PCR,擴(kuò)增,DNA,片段的原理,3,結(jié)合教材，嘗試進(jìn)行目的,DNA,片段的體外擴(kuò)增,重難點(diǎn)擊,1,了解,PCR,技術(shù)的基本操作,2,理解,PCR,的原理,一、使用,PCR,儀的安全措施和,PCR,反應(yīng)程序,二、目的,DNA,片段的體外擴(kuò)增與鑒定,內(nèi)容索引,當(dāng)堂檢測(cè),一、使用,PCR,儀的安全措施和,PCR,反應(yīng)程序,1.DNA,分子的結(jié)構(gòu),1,寫(xiě)出各個(gè)標(biāo)號(hào)的名稱,基礎(chǔ)梳理,胞嘧啶,腺嘌呤,鳥(niǎo)嘌呤,胸腺嘧啶,脫氧核糖,磷酸基團(tuán),胸腺嘧啶脫氧核苷酸,氫鍵,堿基對(duì),一條脫

2、氧核苷酸鏈,2)DNA,的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?為了明確表示,DNA,鏈的方向,通常將,DNA,的羥基末端稱為,3,端，將磷酸基團(tuán)的末端稱為,5,端，按此原則在圖上方框內(nèi)標(biāo)出,兩條鏈的方向,答案,左鏈上,5,端，下,3,端,右鏈上,3,端，下,5,端,答案,2,細(xì)胞內(nèi),DNA,復(fù)制條件分析,條件,組分,作用,模板,DNA,的,條,單鏈,提供復(fù)制的模板,原料,四種,_,合成,DNA,子鏈的原料,酶,解旋酶,打開(kāi),_,兩,脫氧核苷酸,DNA,雙螺旋,合成,DNA,子鏈,ATP,3,端,3.PCR,技術(shù),1,概念：在,快速擴(kuò)增,的技術(shù),稱為,PCR,技術(shù),2,物質(zhì)條件,3)PCR,反應(yīng)的過(guò)程及結(jié)果,P

3、CR,反應(yīng)程序,a,在,94,高溫下，作為模板的,解旋成為,b,反應(yīng)體系的溫度降至,引物與作為模板的單鏈,DNA,上的,相互配對(duì),體外,特定基因或,DNA,序列,目的,DNA,片段,DNA,模板,四種脫氧核苷酸,Taq,DNA,聚合酶,引物,變性,雙鏈,DNA,單鏈,DNA,退火,復(fù)性,55,特定部位,c,反應(yīng)體系的溫度回升到,按照單鏈,DNA,上的脫氧,核苷酸序列,4,種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在,Taq,DNA,聚合,酶的作用下連接到引物之后，使引物鏈延伸，形成互補(bǔ)的,結(jié)果,a.PCR,擴(kuò)增一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括,_,三步,b,兩引物之間的固定長(zhǎng)度的,DNA,序列呈

4、,擴(kuò)增,延伸,72,左右,DNA,雙鏈,變性、退火,延伸,指數(shù),問(wèn)題探究,1.PCR,原理,PCR,反應(yīng)與體內(nèi),DNA,復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同？請(qǐng)分析原因,答案,不相同。體內(nèi),DNA,復(fù)制所需引物為,RNA,聚合酶合成的一小段,RNA,但,PCR,反應(yīng)時(shí)所用引物一般是人工加入的一小段單鏈,DNA,答案,2.PCR,反應(yīng)過(guò)程,1)PCR,反應(yīng)中需要解旋酶和,DNA,聚合酶嗎？若需要，則與細(xì)胞內(nèi),DNA,復(fù)制有何區(qū)別,答案,PCR,反應(yīng)不需要解旋酶，但需要,DNA,聚合酶。由于,PCR,反應(yīng)中需,要高溫使,DNA,解旋，因此,PCR,所需的,DNA,聚合酶能耐高溫,2)PCR,的每次循環(huán)中

5、應(yīng)如何控制溫度？請(qǐng)分析原因,答案,每次循環(huán)中先高溫解旋，再低溫使引物與模板結(jié)合，最后適當(dāng)升,溫有利于,Taq,DNA,聚合酶發(fā)揮作用,答案,3,結(jié)合下圖分析,PCR,過(guò)程中,DNA,復(fù)制的方向是怎樣的,答案,PCR,擴(kuò)增與,DNA,復(fù)制的異同,歸納總結(jié),項(xiàng)目,DNA,復(fù)制,PCR,擴(kuò)增,不,同,點(diǎn),時(shí)期,有絲分裂間期或減數(shù)第一次,分裂的間期,任何時(shí)期,場(chǎng)所,活細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞外,酶,解旋酶,DNA,聚合酶,耐高溫的,Taq,DNA,聚合酶,引物,有轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生,RNA,作引物,無(wú)需人工加入,無(wú)轉(zhuǎn)錄，無(wú)引物產(chǎn)生，需人工加,入兩種,DNA,引物,特點(diǎn),邊解旋邊復(fù)制,先全部解旋后開(kāi)始復(fù)制,緩沖液,不需緩沖

6、液,配制緩沖液代替細(xì)胞核液,設(shè)備,無(wú),控制溫度變化的溫控設(shè)備,相,同,點(diǎn),原理,嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,引物,都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引,物,模板,DNA,的兩條鏈為模板,特點(diǎn),半保留復(fù)制,原料,游離的四種脫氧核苷酸,解析,DNA,聚合酶不能從頭開(kāi)始合成,DNA,故,DNA,復(fù)制需要引物,DNA,聚合酶只能從,3,端延伸,DNA,鏈，而不能從,5,端延伸,DNA,鏈,引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與,DNA,母鏈相結(jié)合,PCR,擴(kuò)增的對(duì)象是,DNA,不是氨基酸序列,拓展應(yīng)用,1,下列關(guān)于,DNA,復(fù)制和,PCR,技術(shù)的描述中，正確的是,A.DNA,聚合酶不能從頭開(kāi)始合成,DNA,只能從,

7、5,端延伸,DNA,鏈,B.DNA,復(fù)制不需要引物,C,引物與,DNA,母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合,D.PCR,擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列,答案,解析,解析,PCR,技術(shù)中用高溫使,DNA,分子中的氫鍵打開(kāi)，從而解旋，其原理,是,DNA,的熱變性原理,2.PCR,技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分?DNA,含量太低難以對(duì)樣品進(jìn)行研究,的問(wèn)題，而被廣泛應(yīng)用，與細(xì)胞內(nèi)的,DNA,復(fù)制相比,PCR,可以快速擴(kuò)增,所需的,DNA,片段，請(qǐng)分析回答下列有關(guān)問(wèn)題,1,體內(nèi),DNA,復(fù)制過(guò)程中用解旋酶打開(kāi)雙鏈,DNA,而,PCR,技術(shù)中的解旋,原理是,答案,解析,DNA,的熱變性原理,2,此過(guò)程需要一種,Taq,DN

8、A,聚合酶。該酶是從,中分離的,解析,Taq,DNA,聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌,Taq,中提取的,3,與普通,DNA,聚合酶相比,Taq,DNA,聚合酶具有的特性是,解析,與普通,DNA,聚合酶相比,Taq,DNA,聚合酶在,90,以上的環(huán)境中不,變性，具有耐高溫的特性,4,與體內(nèi),DNA,復(fù)制相比較,PCR,反應(yīng)要在,中才能進(jìn)行,并且要嚴(yán)格控制,條件,解析,PCR,反應(yīng)需要適宜的溫度和,pH,因此,PCR,反應(yīng)要在一定的緩沖溶,液中進(jìn)行，并需嚴(yán)格控制好溫度條件,答案,解析,水生耐熱細(xì)菌,Taq,耐高溫,一定的緩沖溶液,溫度,5)PCR,中加入的引物有,種，加入引物的作用是,解析,PCR,需要兩

9、種引物，引物的識(shí)別位點(diǎn)決定了,PCR,擴(kuò)增的,DNA,片,段,PCR,中加入的引物一般是一小段單鏈,DNA,作用是引導(dǎo),DNA,復(fù)制,可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為,DNA,復(fù)制的,起點(diǎn),答案,解析,2,作為,DNA,復(fù)制的起點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)的,DNA,復(fù)制需要適宜的溫度和,pH,嗎？若需要，是如何實(shí)現(xiàn)的,答案,需要。細(xì)胞內(nèi)的適宜溫度和,pH,與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，低等生物,與環(huán)境因素有關(guān),答案,一題多變,與,PCR,原理有關(guān)的三個(gè)易錯(cuò)點(diǎn),1,酶的作用位點(diǎn)：解旋酶的作用是使,DNA,兩條鏈之間的氫鍵斷開(kāi),DNA,聚合酶與,DNA,連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認(rèn)為解旋,

10、酶也作用于磷酸二酯鍵,2)DNA,聚合酶和,DNA,連接酶,DNA,聚合酶是將單個(gè)核苷酸連接到已有的,單鏈片段的,3,端上，需要模板；而,DNA,連接酶連接的是兩條,DNA,片段的,缺口，不需要模板,3)PCR,中的解旋過(guò)程,PCR,過(guò)程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開(kāi),氫鍵，但此時(shí)的溫度不會(huì)破壞磷酸二酯鍵，因此,DNA,加熱變性后變?yōu)?單鏈，并未分解成單體,易錯(cuò)提醒,二、目的,DNA,片段的體外擴(kuò)增與鑒定,基礎(chǔ)梳理,1.DNA,片段的,PCR,擴(kuò)增,1,準(zhǔn)備器材,PCR,儀、臺(tái)式高速離心機(jī),0.2,mL,PCR,微量離心管、自動(dòng)取,液器、模板,DNA,等,2,在,0.2 mL PCR,微

11、量離心管中加入,緩沖液,_,的溶液各,5,L,模板,DNA,引物,1,和,5,L,引物,2,雙蒸水,3,煮沸,之后冰浴,低速離心，按照,1,單位,L,加,入,4,擴(kuò)增,DNA,片段的反應(yīng)程序：將微量離心管放入,PCR,儀中，蓋上樣品池蓋,在,的條件下預(yù)熱,5 min,再設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?_,5 L 10,倍濃縮的,PCR,4,種脫氧,核苷酸,1 L,5 L,29 L,5 min,2 min,Taq,DNA,聚合酶,94,94,30 s,55,30 s,72,1 min,72,1 min,2.DNA,分子的測(cè)定,1,配制二苯胺試劑：分別配制,A,液,1.5 g,二苯胺溶于,100 mL,中，再,加

12、入,1.5 mL,濃硫酸，用棕色瓶保存,和,B,液,體積分?jǐn)?shù)為,0.2,的,溶液,將,0.1 mL B,液加入,10 mL A,液中，混勻,2,條件：取一定量擴(kuò)增前和擴(kuò)增后的溶液分別放入等量的二苯胺試劑,混勻后觀察顏色變化。用,加熱上述溶液,3,現(xiàn)象：出現(xiàn),現(xiàn)象,3,定量分析方法,如果需要進(jìn)行定量分析,可以采用,或,_,前者需要使用,后者需要使用,等,冰醋酸,乙醛,沸水浴,藍(lán)色,紫外分光光度法,瓊脂,糖凝膠電泳法,紫外分光光度計(jì),電泳儀,問(wèn)題探究,1,實(shí)驗(yàn)過(guò)程分析,1,離心的目的是什么？在離心的過(guò)程中，微量離心管的蓋子為什么一定,要蓋嚴(yán),答案,離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效率

13、。微量,離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢,2,在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁，目的是什么,答案,離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應(yīng)液混合均勻,答案,3)PCR,實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、取液器、緩沖液以及蒸餾水等在使,用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，為什么這樣操作？還有哪些操作與此目,的相同,答案,為避免外源,DNA,等的污染。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí),每吸取一種試劑后，取液器上的槍頭都必須更換,答案,2,結(jié)果檢測(cè),1,實(shí)驗(yàn)中為什么要測(cè)定,DNA,的含量,答案,實(shí)際操作過(guò)程中會(huì)有許多因素影響,DNA,含量，所以需要對(duì),DNA,含,量進(jìn)行測(cè)定,2,如何判斷,DNA,擴(kuò)增成功,答案

14、,可以通過(guò)計(jì)算,DNA,含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果,電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察,DNA,帶的分布及粗細(xì),程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果,3)PCR,擴(kuò)增過(guò)程可能會(huì)出現(xiàn)哪些異常結(jié)果,答案,樣品產(chǎn)物少，或產(chǎn)生新的,DNA,答案,拓展應(yīng)用,3,進(jìn)行,PCR,反應(yīng)的具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為,設(shè)計(jì)好,PCR,儀的循環(huán)程序,按配方準(zhǔn)備好各組分,用微量移液器,向微量離心管中依次加入各組分,進(jìn)行,PCR,反應(yīng),離心使反應(yīng)液集,中在離心管底部,A,B,C,D,答案,解析,解析,PCR,反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備,包括配制配方及將各配方放于,實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,移液,混合,離心,反應(yīng),PCR,儀是一種自動(dòng)控制,溫度的儀器，設(shè)計(jì)

15、好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了,4,近,20,年來(lái),PCR,技術(shù),多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī),實(shí)驗(yàn)手段，其原理是利用,DNA,半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行,DNA,的人工復(fù)制,如圖,在短時(shí)間內(nèi)，將,DNA,擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，從而使實(shí)驗(yàn)室,所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體,1,加熱使,DNA,雙鏈間的,鍵完全打開(kāi)，稱為,而在細(xì)胞中是在,酶的作用下進(jìn)行的,答案,解析,氫,解旋,解旋,解析,PCR,技術(shù)利用熱變性原理使,DNA,雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為解旋,而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂,答案,解析,2,如果只需要大量克隆模板,DNA,中間的某個(gè)特定區(qū)段，應(yīng)該加入,種

16、特,定的引物。當(dāng)溫度降低至,55,時(shí)，引物與兩條,舒展,的模板鏈的特定位,置結(jié)合，在,DNA,聚合酶的作用下，只能在引物的,端連接脫氧核苷酸,兩條子鏈的延伸方向都是,兩,3,從子鏈的,5,端向,3,端延伸,解析,PCR,技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的,DNA,復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料,酶以外，至少還需要液體環(huán)境,穩(wěn)定的緩沖溶液,每一個(gè)步驟都需要適宜,的溫度和酸堿度等,答案,解析,3)PCR,技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個(gè)條件,即液體環(huán)境、適宜的,和,前者由,自動(dòng)調(diào)控，后者則靠,來(lái)維持,溫度,酸堿度,PCR,儀,緩沖液,解析,一個(gè),DNA,分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成,16,個(gè),D

17、NA,分子,15,N,標(biāo)記的,DNA,分子有,2,個(gè)，則,15,N,標(biāo)記的,DNA,分子占全部,DNA,分子總數(shù)的比例為,1/8,答案,解析,4,通過(guò),PCR,技術(shù)使,DNA,分子大量復(fù)制，如果將一個(gè)用,15,N,標(biāo)記的,DNA,分子,放入試管中，以,14,N,標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則,15,N,標(biāo)記的,DNA,分子占全部,DNA,分子總數(shù)的比例是,1/8,問(wèn)題導(dǎo)析,課堂小結(jié),放入,PCR,儀擴(kuò)增,引物,復(fù)性,當(dāng)堂檢測(cè),1.PCR,利用了,DNA,的哪種特性來(lái)控制,DNA,的解聚與結(jié)合,A,特異性,B,穩(wěn)定性,C,熱變性,D,多樣性,2,3,4,5,1,答案,2,符合,PC

18、R,反應(yīng)條件的一項(xiàng)是,穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境,DNA,模板,合成引物,四種脫氧核苷酸,DNA,聚合酶,DNA,解旋酶,限制酶,溫控設(shè)備,A,B,C,D,答案,解析,2,3,4,1,5,解析,PCR,反應(yīng)模擬了生物細(xì)胞內(nèi),DNA,復(fù)制的條件，只是無(wú)需解旋酶,可熱變性,也不需要基因工程的工具酶,限制酶,解析,PCR,是一種體外迅速擴(kuò)增,DNA,片段的技術(shù)，在高溫條件下，把,DNA,的雙鏈打開(kāi)，緩慢冷卻后，又重新結(jié)合，需要耐高溫的,DNA,聚合,酶，同時(shí)，還需要引物，從引物的,3,端連接脫氧核苷酸,3,下列關(guān)于,PCR,的描述中，正確的是,PCR,是一種酶促反應(yīng),引物決定了擴(kuò)增的特異性,擴(kuò)增,DNA,利,用了熱變性的原理,擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列,A,B,C,D,答案,2,3,4,1,5,解析,4,如圖所示為,PCR,擴(kuò)增的產(chǎn)物，請(qǐng)分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物,A,第一次循環(huán),B,第二次循環(huán),C,第三次循環(huán),D,第四次循環(huán),解析,2,3,4,1,答案,5,5,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR,是一種體外迅速擴(kuò)增,DNA