酶的分子修飾

1、第五講 酶分子修飾,第五講 酶分子修飾,教學(xué)目標(biāo)： 了解有關(guān)酶分子修飾的重要應(yīng)用以及酶分子的物理修飾作用 理解蛋白酶化學(xué)修飾的方法和意義 掌握酶分子化學(xué)修飾的形式、目的、原理與特點(diǎn) 教學(xué)重點(diǎn)： 酶分子化學(xué)修飾的方法和意義、酶分子化學(xué)修飾的形式 教學(xué)難點(diǎn)： 化學(xué)修飾的原理與特點(diǎn),第五講 酶分子修飾,5.1、酶分子修飾的定義及其意義 5.2、酶分子修飾方法 5.3、酶修飾后的性質(zhì)變化 5.4、酶的分子定向進(jìn)化,分析酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用受到極大限制的原因,熱穩(wěn)定性差 活力低 耐受pH范圍窄 分子量過(guò)大 成本高 來(lái)源有限 有異體反應(yīng),酶的應(yīng)用受到了很大限制促使科研工作者必須不斷地開(kāi)展新的研究，用化學(xué)或分

2、子生物學(xué)方法對(duì)酶分子進(jìn)行改造，以滿足各種反應(yīng)條件對(duì)酶的需求，克服天然酶的缺陷。 隨著各個(gè)學(xué)科及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，特別對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能的深入了解、基因工程及固定化技術(shù)的普及，酶的分子改造工程進(jìn)入實(shí)用階段。 總體來(lái)說(shuō)酶的分子工程分兩部分： 分子生物學(xué)水平：即用基因工程方法對(duì)DNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更合理的酶蛋白； 對(duì)天然酶分子進(jìn)行改造：包括酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等,5.1、酶分子修飾的定義及其意義,1、定義：通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程,即在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，

3、進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),討論:自然界中存在酶分子改造修飾嗎,酶原激活 可逆共價(jià)調(diào)節(jié),胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原,磷酸化酶a與磷酸化酶b互變,2、酶分子修飾的意義,增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（stability） 提高酶的活力（activity） 降低或消除酶的抗原性（immunological property） 研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象（structure）的影響,3、酶分子修飾的基本要求和條件,1）對(duì)酶性質(zhì)的了解： 酶的穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、抑制劑等 酶活性中心的狀況：活性中心基團(tuán)、輔因子以及分子大小、性狀、亞基數(shù)

4、 （2）對(duì)修飾劑的要求： 良好的生物相容性和水溶性 修飾劑的相對(duì)分子質(zhì)量（較大）、修飾劑鏈的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件 （3）對(duì)酶反應(yīng)條件的選擇： 反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例 反應(yīng)體系中的溶劑性質(zhì)、鹽濃度和pH條件 反應(yīng)溫度及時(shí)間,5.2、酶分子的修飾方法,物理修飾： 不改變酶的組成單位及其基團(tuán)的修飾，即酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素（高溫、高壓、高鹽、極端pH值）作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。 化學(xué)修飾： 廣義:指凡涉及共價(jià)部分或部分共價(jià)鍵的形成或破壞的轉(zhuǎn)變。 狹義:指在較溫和的條件下以可控的方式使一種蛋白質(zhì)與某些化

5、學(xué)試劑起特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)的化學(xué)變化,一、影響酶分子化學(xué)修飾的主要因素,1、酶蛋白功能基團(tuán)的反應(yīng)性 蛋白質(zhì)功能基團(tuán)所處的環(huán)境會(huì)強(qiáng)烈地影響它的物理和化學(xué)性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子的表面特點(diǎn)也影響化學(xué)試劑的接近 因此，有必要考察局部衡區(qū)對(duì)功能基和修飾劑的影響。由于功能基的反應(yīng)性是通過(guò)它的親核性來(lái)測(cè)量的，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)pKa和影響pKa的因素。 2、修飾劑的反應(yīng)性,1、影響酶蛋白功能基團(tuán)的反應(yīng)性因素,微區(qū)的極性 基團(tuán)間的氫鍵 靜電效應(yīng) 位阻效應(yīng) 其它,電荷轉(zhuǎn)移、共價(jià)鍵形成、金屬螯合、旋轉(zhuǎn)自由度,微區(qū)的極性,微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。極性對(duì)整個(gè)反應(yīng)速度影響與反應(yīng)的類

6、型有密切關(guān)系。 從整體看來(lái)，局部極性的改變對(duì)色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的影響較小 對(duì)氨基和組氨酸反應(yīng)性的影響較大 對(duì)酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應(yīng)性影響最大,基團(tuán)間的氫鍵作用,在蛋白質(zhì)的酚基-羧基相互作用中，羧基的pKa應(yīng)比正常值低，而酚基的pKa高于正常值,H,靜電效應(yīng),用高分辨率的核磁共振組氨酸殘基的電離行為進(jìn)行研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pKa是不同的； 原因可能在于帶電基團(tuán)相互靜電作用的影響,位阻效應(yīng),烷基在空間上緊靠功能基，會(huì)使修飾劑不能與功能基接觸，出現(xiàn)位阻效應(yīng)。 對(duì)枯草桿菌蛋白酶BPN的X射線衍射研究指出：10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且苯酚的羥基幾乎在所有情況

7、下都沒(méi)有形成氫鍵。對(duì)它進(jìn)行徹底硝化和碘化后，10個(gè)酪氨酸中只有8個(gè)被修飾。若沒(méi)有X射線衍射研究結(jié)果，很可能解釋為至少有2個(gè)酪氨酸殘基被包埋在分子內(nèi)部，但實(shí)際情況并不是這樣的，這種情況很可能是空間障礙引起的,旋轉(zhuǎn)自由度,加快修飾反應(yīng)速度的一個(gè)重要原因是限制了構(gòu)象的總數(shù)(即限制了旋轉(zhuǎn)自由度)，這種限制可能是由于上述提及的幾類相互作用引起的。 酚酸的酯化速度：在苯環(huán)上引入幾個(gè)甲基，特別是在同一碳原子上引入2個(gè)甲基，則限制了基團(tuán)的自由旋轉(zhuǎn)，因而使酚酸的酯化速度常數(shù)提高了108倍以上,2、影響修飾劑反應(yīng)性的因素,選擇吸附 靜電相互作用 位阻因素 催化因素,選擇吸附,化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)選擇

8、性地吸附在低極性區(qū)或高極性區(qū)，有時(shí)可以根據(jù)對(duì)速度的飽和效應(yīng)，檢測(cè)出蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物的形成。 正像酶-底物復(fù)合物那樣，蛋白質(zhì)修飾劑復(fù)合物形成后，修飾過(guò)程的速度就加強(qiáng)了，這種速度的加強(qiáng)，部分是由于選擇性吸附的結(jié)果,靜電相互作用,帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位，靜電相互作用可使修飾劑向多功能部位中的一個(gè)殘基定位或向雙功能基的一側(cè)定位。修飾劑的靜電取向也是影響其反應(yīng)性的一個(gè)因素。 碘乙酸和碘乙酰胺烷基化速度和烷基化部位差異 此外，靜電排斥力能抑制修飾作用,位阻因素,蛋白質(zhì)表面的位阻因素或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。但修飾的結(jié)果

9、卻能提供有關(guān)蛋白質(zhì)表面的有用信息。 用a溴代丁酸可烷基化核糖核酸酶第l2號(hào)組氨酸，而且反應(yīng)進(jìn)行很快； 若用a溴代戊酸作修飾劑，則很難進(jìn)行反應(yīng)； 若用a溴代己酸作修飾劑，則不能發(fā)生烷化反應(yīng),催化因素,修飾部位的其他功能基，如果是產(chǎn)生一般的酸堿催化作用，則也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異。 對(duì)硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對(duì)胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸的乙?；瘜儆谕粰C(jī)理，但苯乙酸鹽的反應(yīng)性差，這在較大程度上與酶的酸堿催化有關(guān)。 氟磷酸鹽與氯磷酸鹽相比，對(duì)絲氨酸酶有非常高的反應(yīng)性，這可能與一般酸堿催化除去氟原子有關(guān),3、修飾反應(yīng)專一性的控制,1)試劑的選擇 (2)反應(yīng)條件的選擇

10、(3)反應(yīng)的專一性,1)試劑的選擇,一般來(lái)說(shuō)，選擇蛋白質(zhì)修飾劑要考慮以下問(wèn)題： 修飾反應(yīng)要完成到什么程度 對(duì)個(gè)別氨基酸是否專一 在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒(méi)有限度 修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變 是否需要分離修飾后的衍生物 反應(yīng)是否可逆 是否適合于建立快速、方便的分析方法,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和試劑的空間結(jié)構(gòu)之間的相互影響也能加強(qiáng)修飾反應(yīng)速度和反應(yīng)的專一性。 對(duì)核糖核酸酶A第119號(hào)組氨酸和第l2號(hào)組氨酸的修飾，使用不同的試劑，這兩個(gè)殘基的反應(yīng)速度就不同。 烷基化反應(yīng)在第l2號(hào)組氨酸；羧甲基化反應(yīng)選擇性修飾第119號(hào)組氨酸。 一般來(lái)說(shuō)，試劑的體積小一些為宜，這樣既能保證修飾反應(yīng)順利進(jìn)行，又可減少

11、因空間障礙而破壞蛋白質(zhì)分子嚴(yán)密結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn),2)反應(yīng)條件的選擇,蛋白質(zhì)與修飾劑作用所要求的反應(yīng)條件，除允許能順利進(jìn) 行外，還必須滿足以下要求： 一是不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性（做對(duì)照實(shí)驗(yàn)）； 二是有利于專一性修飾蛋白質(zhì)（反應(yīng)的溫度、pH、反應(yīng)介質(zhì)、緩沖液）。 氯離子能夠抑制碳酸酐酶的酯酶活力，所以修飾反應(yīng)緩沖液中不能含有氯離子； 磷酸鹽是某些酶的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，該離子的結(jié)合可能會(huì)封閉修飾部位； 鈣離子對(duì)-淀粉酶的激活作用,3)反應(yīng)的專一性,利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性： 二異丙基氟磷酸酯(DEP)能與胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸作用迅速導(dǎo)致酶失活，但DEP在同樣條件下卻不能與胰凝乳蛋白酶原及一些簡(jiǎn)單的

12、模擬化合物作用； 選擇不同的反應(yīng)pH值： 蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)(pKa)是不同的。如用溴(碘)代乙酸(或其酰胺)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí)： 當(dāng)反應(yīng)pH值為6時(shí)，只專一與組氨酸的咪唑基作用； 當(dāng)反應(yīng)pH值為3時(shí)，則專一與甲硫氨酸側(cè)鏈作用,反應(yīng)的專一性,利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性： 在高pH值下，用二硫化碳、O一甲基異脲和亞氨酸等可將氨基轉(zhuǎn)變成脲和胍的衍生物。雖然巰基也能與上述試劑作用，但因pH值高，與巰基形成的產(chǎn)物可被迅速分解。 親和標(biāo)記： 實(shí)現(xiàn)專一性修飾的重要途徑，親和標(biāo)記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。 在作用前試劑是先以非共價(jià)鍵形式結(jié)合到蛋白質(zhì)的

13、活性部位上，然后再發(fā)生化學(xué)作用，將試劑置于活性部位基團(tuán)上。 對(duì)甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸,反應(yīng)的專一性,差別標(biāo)記： 在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們保護(hù)著蛋白質(zhì)的活性部位基團(tuán)，使這些基團(tuán)不能與試劑作用，然后將過(guò)量的底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位素標(biāo)記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來(lái)被底物或抑制劑保護(hù)的基團(tuán)是帶放射性同位素標(biāo)記的。用這一方法可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)； 利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異： 有時(shí)在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。 核糖核酸酶在晶體狀態(tài)下進(jìn)行羧甲基化時(shí)，反應(yīng)主要集中在第119號(hào)組氨酸上，對(duì)第12號(hào)組氨酸修飾很少

14、，兩者之比為60：1；但在水溶液中進(jìn)行同樣的修飾，兩者之比為15：1,4、修飾程度和修飾部位的測(cè)定,1)分析方法： 光譜法：要求修飾后的衍生物具有獨(dú)特的光譜或它的光譜與修飾劑的不同； 間接法：同位素標(biāo)記、有色修飾劑的光譜強(qiáng)度、順磁共振譜、熒光標(biāo)記。 (2)化學(xué)修飾數(shù)據(jù)的分析： 時(shí)間進(jìn)程分析獲得時(shí)間進(jìn)程曲線，可以了解修飾殘基的性質(zhì)和數(shù)目以及修飾殘基與蛋白質(zhì)生物活性之間的關(guān)系等； 確定必需基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)目：鄒氏作圖法（1962年鄒承魯,二、酶分子的化學(xué)修飾,1、金屬離子置換修飾 2、大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià)) 3、側(cè)鏈基團(tuán)修飾 4、肽鏈有限水解修飾 5、氨基酸置換修飾,1、金屬離子置換修飾,把

15、酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法,淀粉酶中的鈣離子（Ca2+） 谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+) 過(guò)氧化氫酶分子中的亞鐵離子(Fe2+) ?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+） 超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2,酶的金屬離子置換修飾,若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。 如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。 若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性,金屬離子置換修飾的過(guò)程,酶的分離純化： 首先將欲進(jìn)行

16、修飾酶經(jīng)過(guò)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液； 除去原有金屬離子： 加入一定量的金屬螯合劑（如乙二胺四乙酸（EDTA）等）使酶分子中的金屬離子與螯合劑形成螯合物，通過(guò)透析、超濾、分子篩層析等方法將金屬螯合物從酶液中除去，酶往往成為無(wú)活性狀態(tài)； 加入置換離子： 在去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過(guò)金屬離子置換后的酶。 注： 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來(lái)含有金屬離子的酶； 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子,2、大分子結(jié)合修飾,一、非共價(jià)修飾,二、共價(jià)修飾,一、非共價(jià)修飾,使用一些能與

17、酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，既能通過(guò)氫鍵固定在酶分子表面，也能通過(guò)氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。 一類添加物通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶的活力，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等； 一類添加物通過(guò)分子之間相互作用排除表面區(qū)域內(nèi)的水分子，從而增加其穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì),二、共價(jià)修飾,用可溶性大分子通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。 用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，降低或消除酶的抗原性，提高了抗蛋白酶能力，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。 1分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 1分子胰凝乳蛋白酶與11分子

18、右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍,聚乙二醇,聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，被廣泛用于酶的修飾,大分子共價(jià)修飾過(guò)程,修飾劑的選擇： 根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。 修飾劑的活化： 作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起，在使用之前一般需要經(jīng)過(guò)活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。 修飾： 將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)

19、分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 分離： 需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶,3、氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾,采用一定的化學(xué)方法使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。 酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。

20、用于研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用,氨基酸殘基,活性中心7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Ser； 根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類： 非極性R基氨基酸（共8種）：Ala、Leu、Val、Ile、Phe、Try、Met、Pro； 中性的極性R基氨基酸（共7種）：Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gly、Gln； 帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：Lys、Arg、His； 帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：Asp、Glu,催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾,對(duì)非催

21、化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力。經(jīng)常被修飾的殘基有： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp 對(duì)催化活性基團(tuán)可以通過(guò)選擇性修飾側(cè)鏈成分來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代,討論：酶的修飾反應(yīng)的主要類型,?；磻?yīng) 烷基化反應(yīng) 氧化和還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng),1) ?；磻?yīng),化學(xué)修飾試劑有乙酰咪唑、二異丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基異脲等，在室溫(2025)、pH值為4.59.0的條件下可與酶分子的某些側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生酰基化反應(yīng)。 作用于酶分子側(cè)鏈基團(tuán)有氨基、羥基、巰基以及酚基等,2) 烷基化反應(yīng),飾試劑的特點(diǎn)常常是帶有活潑的鹵素原子，

22、由于鹵素原子的電負(fù)性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)(例如-NH：、-SH等)發(fā)生烷基化。 修飾試劑：2，4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰鹵代物和碘甲烷等。 作用于分子的側(cè)鏈基團(tuán)有氨基、巰基、羧基、硫醚基和咪唑基等,3)氧化和還原反應(yīng),氧化性試劑有H202、N-溴代琥珀酰亞胺等。易受氧化作用的側(cè)鏈基團(tuán)有巰基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及酚基等。 有些試劑具有很強(qiáng)的氧化性，往往容易使肽鏈斷裂，因此在修飾反應(yīng)中要控制好氧化條件。光敏劑存在下的光氧化是一種比較溫和的氧化作用。值得提出的是連四硫酸鈉或連四硫酸鉀(tetrathionate)是一種溫和的氧化劑，因此在化學(xué)修飾

23、反應(yīng)中常用來(lái)作為巰基可逆保護(hù)劑。 還原修飾試劑有2一巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇(DTT)等,4) 芳香環(huán)取代反應(yīng),酶分子氨基酸殘基的酚羥基在3位和5位上很容易發(fā)生親電取代的碘化和硝化反應(yīng)。 四硝基甲烷(tetranitro-methane，TNM)可以作用于酪氨酸的酚羥基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物，這種產(chǎn)物有特殊的光譜，可用于直接的定量測(cè)定,羧基的化學(xué)修飾反應(yīng),氨基的化學(xué)修飾反應(yīng),巰基的化學(xué)修飾反應(yīng),咪唑基的化學(xué)修飾反應(yīng),胍基的化學(xué)修飾反應(yīng),色氨酸吲哚基的化學(xué)修飾反應(yīng),酚羥基的化學(xué)修飾反應(yīng),4) 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾,利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)

24、發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。 酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法,a、胃蛋白酶原的激活,b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法. 例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。 現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（site dir

25、ected mutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)，是蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段,5) 氨基酸置換修飾,酶分子的定點(diǎn)突變,1、基因序列分析 2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 3、酶活性中心分析 4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變 5、酶基因克隆表達(dá) 6、變異特性分析,4.4 酶修飾后的性質(zhì)變化,熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性有較大的提高。 抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋

26、白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。 各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。 半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期。 最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。 Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒(méi)有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大,4.5 酶的定向進(jìn)化,酶分子的合理設(shè)計(jì)(rational design) 酶分子的定向進(jìn)化(directed evolution,酶的合理設(shè)計(jì),體外定向進(jìn)化的意義,理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開(kāi)發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。 所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過(guò)人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 酶的體外定向