蛋白酶活性的測(cè)定

1、.實(shí)驗(yàn)四 蛋白酶活力的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解蛋白酶活力測(cè)定的原理；2、掌握蛋白酶活力測(cè)定的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵，也能夠水解酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類(lèi)化合物作為底物來(lái)測(cè)定蛋白酶的活力。本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物，測(cè)定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后，降解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸，在反應(yīng)混合物中加入三氯醋酸溶液，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來(lái)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反應(yīng)時(shí)間。在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光度的增加，就可計(jì)算酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)

2、試劑微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：稱取1.0g酶制劑，加100ml蒸餾水?dāng)嚢?0min，在4下離心分離后，將上層清夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍數(shù)；0.02mol/l磷酸鹽緩沖液（ph7.5）；1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml0.2mol/l磷酸鹽緩沖液（ph7.5），加熱并攪拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；5%三氯醋酸（tca）溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、將5%tca溶液和1%酪蛋白溶液在37下保溫。2、取四支15ml具塞試管，分別標(biāo)上記號(hào)a1、a0、b1和b0。在a1和a0試管中各吸入0.20ml酶液，在b1和b0試管中各吸入0.40ml酶液，分別用0.2mol/

3、l磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在a0和b0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支試管都置于37精品.水浴中保溫。3、在各試管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37下保溫10min（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）后，再向a1和b1試管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、將試管從水浴中取出，在室溫下放置1h，用少量上清液潤(rùn)濕濾紙后過(guò)濾，保留濾出液。5、在280nm波長(zhǎng)下，分別以a0和b0濾液為空白，測(cè)定a1和b1濾液的吸光度。五、計(jì)算1、在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，以每分鐘增加0.001吸光度定義為一個(gè)酶單位。2、每克酶制劑中酶活力的計(jì)算： a1000/(tw) 酶活力單位/克酶制劑式中，a樣品與空白

4、吸光度差值（即a1和b1的吸光值）；t酶作用時(shí)間（本實(shí)驗(yàn)為10min）；w反應(yīng)中酶的用量，g六、說(shuō)明1、微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的ph范圍表現(xiàn)出活力，但是在接近中性條件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45以下可保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性。七、思考題1、蛋白酶有哪幾類(lèi)？2、影響酶活力的因素有哪些？3、使用紫外分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？六、數(shù)據(jù)記錄與處理a1 = 0.279 b1 = 0.573 酶含量為 0.001g/ml酶活力1 = a 1000 / (t w) = 0.2791000/10/0.001/0.20=1.395105酶活力單位/克酶制劑酶活力2= a 1000 / (t w)

5、= 0.5731000/10/0.001/0.40=1.4325105酶活力單位/克酶制劑平均值= （1.395105 + 1.4325105）=141375酶活力單位/克酶制劑精品.平均相對(duì)相差= （143250 - 139500）/141375 100%=2.65% 七、思考題 1、蛋白酶有哪幾類(lèi)？答：按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：a內(nèi)肽酶：切開(kāi)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，生成相對(duì)分子質(zhì)量較小的多肽類(lèi)；b外肽酶：切開(kāi)蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類(lèi)；c水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；d水解蛋白質(zhì)或多肽的酰胺鍵。按酶的來(lái)源可分為：動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶微生物蛋白酶又可分為

6、：細(xì)菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白酶按蛋白酶作用的最適ph可以分為（a）ph2.55.0的酸性蛋白酶，（b）ph9.510.5的堿性蛋白酶，（c）ph78的中性蛋白酶 2、影響酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速率來(lái)表示的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來(lái)表示，酶活力的測(cè)定也就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速率。酶濃度對(duì)酶活力的影響：酶促反應(yīng)速率與酶分子的濃度呈正比，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。底物濃度對(duì)酶活力的影響：若酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時(shí)，酶促反應(yīng)速度與底物濃度呈正比，即隨底物

7、濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會(huì)增加，酶促反應(yīng)速度也不會(huì)增加。溫度對(duì)酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而增加，超過(guò)最適反應(yīng)溫度，酶活力將會(huì)下降。ph對(duì)酶活力的影響：酶在最適ph范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適ph，都會(huì)降低酶活性。激活劑對(duì)酶活力的影響：某些無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、陰離子、有機(jī)化合物可作為激活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性。抑制劑對(duì)酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力，它可降低酶促反應(yīng)速度。 3、使用紫外分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？答：使用的比色皿必須潔凈，并注意配對(duì)使用。手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝盛樣品量以2/3為度。透光面要用擦鏡紙擦拭干凈。比色皿使