色譜學 lecture 7.ppt

1、,色譜學 第七講,2011年11月7日,色譜的分類,1,3: normal saturated chambers; 2,4: ultramicro cham2bers ( totally closed layer, w ithout overpressure); 5,6,7: OPLC chambers (plates w ith11,5, and3m particle sizes, respectively).,加壓薄層色譜法（Overpressured Layer Chromatography）,Importance of Theoretical Plates (N),HPLC Chrom

2、atograph of Muscadine Grape Juice,Water-Soluble Vitamins,Water-Soluble Vitamins,高效液相色譜法,H,P,igh,erformance,L,iquid,C,hromatography,H,P,igh,ressure,L,iquid,C,hromatography,H,P,igh,riced,L,iquid,C,hromatography,概述 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基

3、礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：,1高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法,高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達 103cmmin-1.例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3h-1，

4、需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分.,高效液相色譜法特點：,1.高壓：一般：150300kg/cm2 甚至：500kg/cm2 2.高速：兩相間交換：千分之幾秒 分析時間較經(jīng)典法少很多(幾分幾十分鐘) 3 高效：氣相：2000塔板/米 液相：5000塔板/米 4.高靈敏度：紫外檢測器：109g數(shù)量級 熒光檢測器：1011g(百萬分之幾） 試樣量?。◣孜⑸?5.高選擇性：可分析在性質(zhì)上極為相似化合物 （手性化合物、同位素、同分異構(gòu)

5、、空間異構(gòu)）,與氣相色譜比較： 相同點：都是重要的分離、分析手段 氣相的基本理論（塔板理論、定性定量方法） 基本術(shù)語（色譜參數(shù)、色譜圖、色譜柱效） 不同點： 應(yīng)用范圍：氣相：易揮發(fā)、熱穩(wěn)定 液相：不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定但具有一定 溶解性化合物，不適合氣體。 流動相作用：氣相：運載樣品，不影響色譜分離 液相：運載樣品，參與、影響色譜分離， 且起主要作用。 分析樣品：氣相：破壞樣品，不能回收。 液相：不破壞樣品，能回收。 說明：,高效液相色譜,高效液相色譜儀,高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。其

6、工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。,19,進樣系統(tǒng),高壓輸液裝置,分離系統(tǒng),檢測系統(tǒng),色譜儀器系統(tǒng)比較,GC System,I 高效液相色譜儀,高效液相色譜儀的流程,高效液相色譜儀的高壓泵,高效液相色譜儀的檢測器,高效液相色譜儀的生產(chǎn)廠家,高效液相色譜儀的分離柱,流 程,儀器裝置 液相色譜儀可分為四大系統(tǒng)： 泵系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng),泵系統(tǒng),泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢,高效：填料顆粒分

7、離效率 柱壓降泵的工作壓力 分析時間短：更快流速柱壓降 減少洗脫液用量 液相色譜的多元洗脫系統(tǒng),泵的分類,進樣系統(tǒng),高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。,進樣閥,六通閥,高效液相色譜儀的色譜柱,球形填料,不規(guī)則形填料,高效液相色譜儀的檢測器,紫外可見分光光度檢測器,特點:,應(yīng)用廣泛、靈敏、線性寬 溫度不敏感 流動相流速不敏感、可梯度,10-9 g / ml

8、,二極管陣列檢測器,特點:,可得到吸收光譜 定性功能強 峰純度檢驗,10-8 g / ml,光電二極管陣列檢測器,熒光檢測器,Stokes熒光,F=2.3 QKI0bC,10-12 g / ml,特點:,特征性強、靈敏,示差折光檢測器,示差折光光路結(jié)構(gòu)示意圖,R=Z C（ni - n0）,10-6 g / ml,6 高效液相色譜儀的生產(chǎn)廠家,Waters,Agillent,Shimadz,Perkin Elmer,Varian,大連依利特公司,北京東西電子研究所,制造商,高效液相色譜儀LC-2010HT島津（香港）有限公司,返回,II 液相色譜的基本分離模式,反相液相色譜,正相液相色譜,離子交

9、換色譜,離子色譜,親和作用色譜,體積排阻色譜,疏水作用色譜,1 含義 固定相-極性，流動相-非極性 2 分離機理,溶質(zhì)和固定相及流動相之間的分子作用力，其中氫鍵力和靜電力起著重要的作用,正相液相色譜,NORMAL PHASE,1980 2004 30% 5% Silica Gel 47% 44% Silica based bonded phases Diol Amino Cyano 3% 1% Alumina 20% 50% Chiral Bonded Phases,4 正相色譜的流動相,常用己烷、環(huán)己烷，乙醚、四氯化碳、二氯甲烷、 甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃等,正相色譜常用溶劑的極性參數(shù)及

10、其溶劑沖洗強度,5 正相色譜的應(yīng)用,主要應(yīng)用于甾醇類、類脂化合物、磷脂類化合物、 脂肪酸以及其他有機物,環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑) 檢測器：差示折光檢測器,可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。,反相色譜reversed phase chromatography, RPC,固定相：非極性的反相介質(zhì)，即為疏水性介質(zhì)(R1,R2多為甲基，R為C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制備的試劑最多，統(tǒng)稱為ODS Octadecyl silica)。 烷基化密度：45%，55%的

11、羥基用 三甲基氯硅烷覆蓋，使表面完全 非極性化。 溶質(zhì)在介質(zhì)上的分配系數(shù)處決于溶質(zhì)的疏水性，疏水性大，m高。 流動相：極性有機溶劑的水溶液(甲醇,乙晴, 異丙醇、正丙醇和四氫呋喃 等) 洗脫：有機溶劑增加。,2 分離機理,反相液相色譜,3 反相色譜的色譜柱（固定相） 常用的固定相-非極性的化學鍵合相。C18，C8，C4等。,反相HPLC-固相載體化學鍵合相,C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3,CNCyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN,C-18Octadecyl Silyl -Si-(CH2)17-CH3,C-8Octyl Silyl -Si-(CH

12、2)7-CH3,80%Octadecylsilica (ODS, C18) 10%Octylsilica (C8) 5%Butylsilica (C4) 3% Phenyl 2%Cyano (CN),反相色譜的色譜柱,4 反相色譜的流動相,通常用的有水、甲醇、乙醇、乙睛等，可用醋酸、磷酸調(diào)節(jié)PH值，用三乙胺作為堿性添加劑改善色譜峰的形狀。,反相色譜常用流動相溶劑的物理性質(zhì),5 反相色譜法具有以下特點,（1）柱子使用壽命較長 （2）流動相可靈活選擇 （3）應(yīng)用范圍特別廣泛,反相色譜的保留機理 疏溶劑理論 雙保留機理 分離對象： 同系物：烷烴數(shù)tR 直鏈tR支鏈tR 化合物極性 tR 固定相對組分

13、保留的影響： 碳鏈長度：碳鏈 tR 烷基覆蓋量：覆蓋量 tR,反相色譜中流動相選擇,水有機改善劑 常用：甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán) 極性：有機改善劑水 洗脫能力：有機改善劑水 極性順序：甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃 洗脫順序：水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃,反相鍵合相色譜的優(yōu)點,流動相可選用水溶性 .樣品的溶解度范圍提高 .流動相可變性大 .柱重現(xiàn)性好 固定相表面化學能低 .平衡容易 .梯度洗脫 固定相選擇多 固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好,缺點：,流動相PH范圍要控制（PH28） PH太低：Si-C鍵易斷裂 PH太高：硅膠基質(zhì)易溶解 游離的硅羥殘基影響分離,6 反相液相色譜的應(yīng)用,占液相色譜的7

14、0-80% 小分子有機物、農(nóng)藥、氨基酸、低聚核苷酸、肽 生物大分子核酸、蛋白質(zhì)等（50KD）,稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。,固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 C 柱 壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器,Reversed-Phase vs. Normal Phase,Separation of 2-Me-Phenol and 4-Me-Phenol in RP and NP,Reversed-Phase MeOH/Water, Luna-C18,Normal Phase Hexa

15、ne/IPA, Luna-Si,90/10,60/40,95/5,98/2,Tocopherols,TocopherolsTocotrienolsR1R2 a-Tocopherol (a-T)a-Tocotrienol (a-3)_MeMe b-Tocopherol (b-T)b-Tocotrienol (b-3)MeH g-Tocopherol (g-T)g-Tocotrienol (g-3)HMe d-Tocopherol (d-T)d-Tocotrienol (d-3)HH,Tocotrienols,Genesis silica column (250 x 4.6 mm, 4 m). M

16、obile phase: Hexane-1,4-dioxane (96:4). . J. Chromatogr. A, 881 (2000) 217-227,Separation of synthetic tocopherols by reversed phase HPLC (280 nm) :1) d-tocopherol, 2) g-tocopherol, 3) b-tocopherol, 4) a-tocopherol, 5)a-tocopheryl acetate,Food Chemistry, 76 (2002) 357 362.,Experimental Comparison of

17、 NP and RP HPLC,液液色譜法的固定相 由載體與固定液構(gòu)成 載體: 全多孔型或薄殼型 涂漬適當?shù)墓潭ㄒ?化學鍵合固定相,液-液分配色譜法固定相,利用化學反應(yīng)的方法通過化學鍵把各種不同的有機分子（固定液）鍵合到載體表面，這樣制得的填料稱化學鍵合相，簡稱鍵合相。其優(yōu)點是： 使用過程中固定液不遺失；化學性能穩(wěn)定，在pH28的溶液中不變質(zhì)；熱穩(wěn)定性好，一般在70以下穩(wěn)定；選擇性好；利于梯度洗脫。,化學鍵合固定相,這類鍵合相表面鍵合的是極性很小的烴基，如十八烷基(C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等。其中以十八烷基硅烷鍵合硅膠（或稱ODS）應(yīng)用最為廣泛，在化學鍵合相中約占 80。它適合分離非極性或極性小的試樣。在應(yīng)用中可選用極性較強的溶劑，如水。甲醇、乙醇或無機鹽的緩沖液作流動相。 十八烷基鍵合相（ODS鍵合相）是將十八烷基氯硅烷試劑與硅膠表面的硅羥基，經(jīng)多步反應(yīng)生成ODS鍵合相。,非極性鍵合相,晶體電陣計算:硅膠表面的硅羥基密度為8個/nm2。 化學法測定:5個/nm2，,Si-OH + HO-R Si-OR + H2O 它的反應(yīng)條件是在150-250度下反應(yīng)3-8小時 HPLC早期的一種正相鍵合填料,Si-O-Si鍵型（硅膠與醇類物質(zhì)