二樣品預(yù)處理方法PPT課件

1、.,1,第二章 樣品預(yù)處理方法,一、概述： 1、樣品處理的目的 色譜分析技術(shù) 氣相色譜 高效液相色譜 高效毛細(xì)管電泳 平面色譜 氣相色譜質(zhì)譜 聯(lián)用技術(shù) 液相色譜質(zhì)譜 液相色譜核磁 氣相色譜紅外,.,2,石化過程分析 工業(yè)衛(wèi)生調(diào)查和評(píng)價(jià) 藥物動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究 食品分析 法庭取證分析 色譜法應(yīng)用 醫(yī)療診斷 核能和燃料分析 制藥過程監(jiān)測 化妝品和香料組成分析 商品質(zhì)量檢驗(yàn),.,3,樣品預(yù)處理的目的,除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 濃縮微量的組份 提高檢測的靈敏度及選擇性 改善分離的效果 有利于色譜柱及儀器的保護(hù),.,4,2、樣品處理的必要性和重要性,色譜分析的全過程包括：樣品采集、樣品制備、色譜分析、數(shù)據(jù)

2、處理與結(jié)果表述 樣品種類繁多，其組成、濃度、物理形態(tài)等均是色譜分析測定的影響因素。樣品處理技術(shù)就成為提高分析測定效率、改善和優(yōu)化色譜分析的重要環(huán)節(jié)。,.,5,占樣品分析時(shí)間的比例（ 60%） 樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間 占分析的消耗總成本最大 消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品 實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié) 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素,是決定性的步驟,.,6,3、樣品處理的原則,（1）樣品中可能存在的物質(zhì)組成？濃度水平？ （2）樣品中的主要組分？ （3）采樣方法是非破壞性的還是破壞性的？ （4）收集的樣品必須有代表性。 （5）采用方法必須和分析目的保持一致。 （6）樣品制備過程中盡可能

3、防止和避免待測定組分發(fā)生化學(xué)變化或丟失,.,7,3、樣品處理的原則（續(xù)）,（7）樣品處理中，若進(jìn)行待測定組分的化學(xué)反應(yīng)，則反應(yīng)應(yīng)是已知的和定量完成的。 （8）樣品制備過程中，要防止和避免待測定組分受到污染，減少無關(guān)化合物引入制備過程。 （9）處理過程應(yīng)簡單易行，所用樣品處理裝置的尺寸應(yīng)與處理樣品的量相適應(yīng)。 （10）采用后應(yīng)盡可能快的進(jìn)行分析樣品的制備和分析，或使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ赡墚a(chǎn)生的干擾，做好樣品的保存。,.,8,二、樣品的采集,氣體（包括蒸汽） 涉及的樣品形式 液體（包括乳液） 固體（包括氣體懸浮物、 液體懸浮物） 直接采集 主要采集方法 富集采集 化學(xué)反應(yīng)法采集,.,9,直接采集：只

4、需將樣品直接引進(jìn)容器中，所用容器最好是新的或洗凈后干燥的，以防止其他樣品的殘留影響。 富集采集：是在采集過程中，同時(shí)將待測組分富集，如吸附采樣中選擇合適的吸附材料，在吸附的同時(shí)使待測材料在吸附材料上富集,.,10,使用采集方法的注意事項(xiàng),（1）采集的樣品應(yīng)具有代表性，要注意采樣的時(shí)間、地點(diǎn)及采樣位置的選擇。 （2）所有樣品都要采集雙份，一份分析樣品，一份保存樣品，備復(fù)查時(shí)使用。 （3）樣品的采集和儲(chǔ)存過程要作記錄，詳列采樣時(shí)間、地點(diǎn)、準(zhǔn)確位置等。,.,11,（4）采集儲(chǔ)存中待測組分不應(yīng)有損失或發(fā)生化學(xué)變化。 損失包括揮發(fā)、在儲(chǔ)存容器上的吸附等物理原因 化學(xué)變化包括被氧化、微生物引起的分解、各組

5、分間的化學(xué)反應(yīng)等 （5）避免樣品受到外界污染。 （6）采集后要盡快進(jìn)行分析樣品的制備和分析。,.,12,三、樣品預(yù)處理常用的方法,高速離心 過濾、超濾 選擇性沉淀 萃取 索氏抽提 衍生反應(yīng) 新樣品處理技術(shù)加速溶劑萃?。ˋSE） 濃縮樣品 液-固萃取 / 液-液萃取 固相萃取樣品小柱,.,13,樣品預(yù)處理的過程,.,14,去除微粒,過濾 過濾膜/過濾裝置 有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m) 膜片可更換 一次性使用的膜 使用方便簡單，交叉污染小 有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理 高速離心 大于：10,000g,.,15,超 濾,機(jī)理 超濾是一種基于分子量分離的技術(shù) 目的 根據(jù)分子量的不同把分子、

6、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份 除去小分子樣品中的大分子蛋白 脫鹽,.,16,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白 有機(jī)溶劑 乙腈，甲醇 強(qiáng)酸 三氯乙酸，過氯酸 鹽 50% 硫酸銨 10% TCA,.,17,樣品衍生,提高檢測的靈敏度 增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測的靈敏度 增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測器 改變分離的選擇性 改變組份的基團(tuán)，如： 變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離 典型的例子 氨基酸分析,.,18,加速溶劑萃?。ˋSE）,ASE 是用溶劑對(duì)固體、半固體的樣品進(jìn)行萃取的技術(shù). ASE 的原理是選擇合適的溶劑、通過增加溫度和壓力來提高萃取過程的效率. ASE 可用來替代索氏提取

7、、超聲萃取、手工振搖、煮沸法和其他萃取方法,.,19,三種不同型號(hào)的ASE,ASE100,ASE200 ,ASE300 ,.,20,ASE的突出優(yōu)點(diǎn),快速，15分鐘 溶劑用量少 萃取效率高 樣品基體影響小 可同時(shí)選用四種溶劑萃取 安全，全自動(dòng) ASE建立了環(huán)境, 藥物, 聚合物, 食品, 和化妝品工業(yè)的大量應(yīng)用,.,21,ASE工作流程,加溶劑 時(shí)間 (min) 0.51,加樣品,靜態(tài)萃取 5,氮?dú)獯祾?2,溶劑,泵,吹掃閥,爐體,氮?dú)馄?靜態(tài)閥,收集瓶,萃取池,循環(huán),加熱 5 加壓,萃取結(jié)束 Total (min) 準(zhǔn)備分析1218,新溶劑沖洗0.5,.,22,食品安全評(píng)價(jià)中ASE的應(yīng)用,水

8、果和蔬菜中的農(nóng)藥 動(dòng)物組織中的二噁英和多氯聯(lián)苯 糧食中的農(nóng)藥 糧食中的毒枝菌素 熏肉中的多環(huán)芳烴 葡萄干中的殺真菌劑 咸肉中的硝酸鹽/亞硝酸鹽 一些正在發(fā)展的方法,.,23,ASE的應(yīng)用領(lǐng)域,環(huán) 境,農(nóng)業(yè)、食品,聚合物,制 藥,.,24,濃縮樣品,濃縮樣品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色譜法 液固抽提/固相萃取小柱,.,25,固相萃取（SPE）技術(shù),固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份 固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性 實(shí)驗(yàn)室中6080%的成本及工作量在樣品制備上 加速樣品的制備時(shí)間 降低樣品前處理的成本 提高分析的準(zhǔn)確性及回收率 更容易自動(dòng)化 減少樣品處

9、理步驟 降低對(duì)不穩(wěn)定樣品的影響 提高安全性,.,26,SPE小柱,SPE 小柱的應(yīng)用領(lǐng)域 除去雜質(zhì)及干擾組份 把樣品分成不同極性的組進(jìn)行分析 富集微量的組份 SPE 小柱的主要種類 反相 正相 離子交換,.,27,SPE小柱的種類,根據(jù)SPE小柱的種類及樣品的性質(zhì)，選洗脫強(qiáng)度不同的溶劑把樣品分開 讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用 第一步：讓所感興趣的樣品留在小柱，雜質(zhì)通過小柱 第二步：用不同極性的溶劑，使所感興趣的樣品通過小柱,.,28,各種SPE小柱（一）,正相 使用方法 可先用6到10倍柱體積的非極性溶劑平衡 加入樣品 用非極性溶劑洗脫不想要的組份 用極性溶劑洗脫第一

10、組感興趣的組份 用極性更強(qiáng)的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份 在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如NH2 / CN 確認(rèn)回收率,.,29,各種SPE小柱（二）,反相 使用方法 可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了 樣品溶解在強(qiáng)一些極性的溶劑中 加入樣品 用強(qiáng)極性溶劑洗脫不想要的組份 用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份 用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份 確認(rèn)回收率,.,30,各種SPE小柱（三）,離子交換 使用方法 可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液平衡， 樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中 加入樣品 用弱緩沖液洗脫不想

11、要的組份 用強(qiáng)一些緩沖液（改變pH或離子強(qiáng)度）洗脫第一組感興趣的組份 用更強(qiáng)的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份 確認(rèn)回收率,.,31,SPE小柱的方法開發(fā),SPE方法開發(fā)的幾個(gè)關(guān)鍵因素 文獻(xiàn)查閱 流速控制 同色譜理論：以10ml/min潤濕小柱，15ml/min加載樣品 離子交換填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加載樣品 以15ml/min流速洗脫樣品 注意樣品本底的不同 注意載荷量及加樣方式,.,32,四、生物樣品的制備技術(shù),植物：花、葉、莖、根、果實(shí) 體液：尿、血液、唾液、胃液、膽汁等 生物樣品 動(dòng)物 毛發(fā) 肌肉 組織器官：心、肝、肺、腦、胃、腎、胰腺等 微生物,.,33,生物樣品

12、中需分析的組分： 植物體內(nèi)營養(yǎng)成分、農(nóng)藥殘留等 動(dòng)物體內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物、糖類及有關(guān)化合物、脂類、維生素、核甘、核甘酸及其衍生物、磷酸酯類化合物、固醇類化合物、氨基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大分子,.,34,生物樣品中待測組分存在的形式及處理方法,待測組分存在于體液或細(xì)胞外時(shí)： 用萃取的方法提取、濃縮制備樣品 用沉淀的方法除去干擾組分（蛋白質(zhì)、DNA、多糖） 待測組分存在于生物細(xì)胞內(nèi)： 破碎細(xì)胞，釋放待測組分，再用萃取或沉淀等方法制備樣品,.,35,1.生物樣品的采集,采集生物樣品時(shí)注意事項(xiàng)： （1）注意樣品的代表性、典型性和適時(shí)性 （2）注意采樣部位的準(zhǔn)確，特別是動(dòng)物的組織器官，一定要

13、認(rèn)準(zhǔn) （3）生物樣品一般都有一定的生物活性，樣品采集后要立即處理 （4）生物樣品的采集大部分可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，采樣工具要消毒，最好在無菌的條件下采樣,.,36,2.細(xì)胞的破碎,根據(jù)樣品的不同，采用不同的破碎方法： 動(dòng)物的胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用普通的勻漿器研磨 肌肉及心臟組織較柔韌，要先絞碎再作成勻漿 植物組織用一般碎磨法 含纖維較多組織則必須在搗碎器內(nèi)破碎或加砂研磨 對(duì)具有堅(jiān)韌細(xì)胞壁的微生物，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。,.,37,細(xì)胞破碎方法的分類,.,38,3.生物大分子的提取,提取生物大分子樣品時(shí)條件的選擇： （1）溶劑 常用的溶劑有水、稀酸、稀堿

14、、稀鹽等，也可以采用不同比例的有機(jī)溶劑，如：乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳 選擇溶劑時(shí)要注意物質(zhì)的溶解性，如極性物質(zhì)易溶于極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑；溫度升高時(shí)一般溶解度相應(yīng)增大；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)溶解度增大,.,39,（2）pH值 在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，pH選擇在偏離pI的兩側(cè) 注意測量pH值的準(zhǔn)確性，誤差不應(yīng)超過0.1 （3）溫度 一般提取溫度在5以下 除此之外，還應(yīng)考慮溶劑的離子強(qiáng)度、介電常數(shù)等對(duì)提取效果的影響,.,40,4.蛋白質(zhì)的去除,（1）加熱法 前提條件：待測組分熱穩(wěn)定性好，而其它易產(chǎn)生熱變性 該法最簡單，但只能除去熱變性蛋白,.,41,4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）,（2）鹽析法 原理：利用不同

15、蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低來沉淀去除蛋白質(zhì) 常用的中性鹽有：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉 影響鹽析的條件 鹽的飽和濃度 pH的選擇 蛋白質(zhì)的濃度 溫度的影響,.,42,4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）,（3）有機(jī)溶劑沉淀法 蛋白質(zhì)的沉淀和溶解與溶劑的介電常數(shù)有關(guān) 常用的有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮 （4）等電點(diǎn)沉淀法 原理：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，用酸、堿調(diào)pH值，使蛋白沉淀出來 缺點(diǎn)：蛋白沉淀不完全,.,43,4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）,（5）膜分離法 膜分離技術(shù)：超濾、反滲透析、電滲析、微孔過慮、氣體滲析、超精密過慮等 超濾法的特點(diǎn)（與沉淀法比較） 適用于小量樣品 適用于對(duì)

16、酸堿不穩(wěn)定的樣品 待測物質(zhì)結(jié)合在膜上，影響回收率 超濾膜的材料：醋酸纖維素、聚酰胺、聚砜等,.,44,4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）,（6）凝膠層析 原理：利用分子大小不同的物質(zhì) 在流過凝膠固定相時(shí)的保留時(shí)間不同，分離待測的小分子化合物和大分子蛋白質(zhì)。 （7）柱層析 原理：用能吸附蛋白質(zhì)的材料裝填成小柱。使含蛋白質(zhì)的樣品流過，樣品中的蛋白質(zhì)被柱填料吸附，而待測組分則流出小柱。,.,45,4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）,（8）高速離心 原理：根據(jù)物質(zhì)沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力因子等的不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮、提純的方法。,.,46,5.微透析技術(shù),微透析技術(shù)：實(shí)質(zhì)上是一種膜分離技術(shù)，它利用膜透析原理，微

17、量地對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行流動(dòng)性連續(xù)采樣的新型采樣和色譜樣品制備技術(shù)。,.,47,6.應(yīng)用,例：用HPLC法測定血清和尿中厚樸酚與和厚樸酚時(shí)樣品的制備 厚樸酚、和厚樸酚是木蘭科植物厚樸干皮、根皮、枝皮的主要成分，作用是抗菌、抑制胃潰瘍和防止應(yīng)激性胃功能障礙、抑制血小板聚集、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和降血壓等作用。,.,48,6.應(yīng)用(續(xù)),用于HPLC法測定的樣品制備方法： 0.5 ml 血清或1 ml 尿 分別加入0.5 ml 甲醇，離心 取上清液0.5 ml 加入 0.1 mol/l 的冰醋酸 0.1 ml ， 搖勻； 用乙酸乙酯和乙醚混合液（ v/v為1：1） 2 ml 萃取 離心后，取1 ml 有機(jī)相置

18、尖底試管 在45 水浴中用氮?dú)饬鞔蹈桑?加入HPLC用流動(dòng)相 0.1 ml 分析樣品,.,49,五、導(dǎo)致待測物損失的因素,吸附： 原因之一：玻璃表面或橡膠塞會(huì)吸附藥物，特別是脂肪胺類及含硫化合物。 解決方法： 可采用硅烷化減少玻璃表面的吸附性 非極性提取溶劑中加入少量極性溶劑可減少器皿對(duì)藥物的吸附。,.,50,原因之二：血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形成，常能引起待測物的共沉淀。 解決方法：將全血樣品加入緩沖液后再行提取。 這樣血球散開，藥物可從血球表面解吸，以減少共沉淀的損失。 緩沖液的一定離子強(qiáng)度，可蛋白質(zhì)變性時(shí)形成疏松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉淀的損失。,.,51,化學(xué)降解： 原因： 樣品的化學(xué)和生物學(xué)不穩(wěn)定性常引起化學(xué)分解 光化學(xué)及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應(yīng)加注意。 解決方法：盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的樣品尚需避光操作,.