《綠膿桿菌》PPT課件.ppt

1、化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的檢測,目的： 1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測的基本過程。 2.掌握幾種培養(yǎng)基的配置方法。 3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。 原理： 銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落大小不一，平均直徑2mm3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態(tài)。氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產(chǎn)生氮?dú)?，?2條件下可以生長，可與類似菌區(qū)別。,操作步驟,檢樣前化妝品的處理 接樣于營養(yǎng)肉湯增菌，37，12h，140rpm培養(yǎng) 分離培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物接于十六烷基三甲基溴化銨平 板，

2、 37，18-24h 染色鏡檢,配十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制） 配綠膿菌素測定用培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面培養(yǎng)基,操作步驟,特征性檢驗(yàn) 氧化酶 綠膿菌素 硝酸鹽還原 明膠液化 42 生長 試驗(yàn) 試驗(yàn) 產(chǎn)氣試驗(yàn) 試驗(yàn) 試驗(yàn) 取菌+ 1滴 接菌，37 接菌 接菌 接菌 二甲基對 24h +氯仿 37 24h 37 24h 42 24h 苯二胺 移出+鹽酸 紫紅色（+） 紫紅色（+） 有氣體（+） 溶解成液狀（+） 生長（+） 不變色（-） 不變色（-） 無氣體（-） 未溶解（-） 不生長（-）,實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基

3、的制備及細(xì)菌的分離培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握培養(yǎng)基制備的原理和方法 掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng) 了解滅菌方法,實(shí)驗(yàn)原理,不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件，在實(shí)驗(yàn)室中，微生物的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基來提供的。培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。 除營養(yǎng)條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才表現(xiàn)出最大生命力，因此，應(yīng)針對不同的微生物將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到適當(dāng)范圍。,操作步驟,按培養(yǎng)基配方稱量,加水加熱熔化,調(diào)節(jié)pH值,分裝包裝,滅菌備用,操作步驟,1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝試管 高壓 制成斜面 2.明膠培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH

4、 分裝試管 高壓 直立制成高層 3.硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝有小倒管的試管 高壓 直立制成高層 4.普通瓊脂斜面培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝試管 高壓 制成斜面,注意事項(xiàng),培養(yǎng)基溶解時(shí)，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。 注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。 稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。 加熱后應(yīng)補(bǔ)足液量。 注意做好標(biāo)記。,細(xì)菌的分離培養(yǎng),原理： 通過劃線，將混雜的細(xì)菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落(colony)。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個(gè)菌落，移種培養(yǎng)后，即得到純種細(xì)菌。,方法： 平板劃線法有幾種，可根據(jù)不同情況選用其中一種。 (1)平行劃線法

5、此法適用于含菌不多的液體標(biāo)本，如腦脊液(CSF)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。 左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標(biāo)本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。 將平板轉(zhuǎn)180角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。 將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37培養(yǎng)。,(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標(biāo)本，如糞便，喀痰、細(xì)菌固體培養(yǎng)物等。 劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標(biāo)本涂開并在平板的1/51/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。 將平板轉(zhuǎn)約70角，待接種環(huán)冷

6、卻后，使接種環(huán)通過已劃線的1區(qū)57次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過火焰滅菌。 再轉(zhuǎn)平板約70，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。 重復(fù)上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37培養(yǎng)。,實(shí)驗(yàn)二 染色鏡檢及五項(xiàng)指標(biāo)試驗(yàn),革蘭氏染色方法,涂片干燥固定染色鏡檢 1涂片：取一潔凈的載玻片，用記號(hào)筆在載玻片做好標(biāo)記，并在載玻片中間滴一小滴生理.鹽水，以無菌接種環(huán)挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。 為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留

7、的細(xì)菌。 2干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。 3固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過三次，以固定之。此時(shí)殺死大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。,4染色： 初染:將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，1min。 媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。 脫色：水洗后用95乙醇脫色，并搖動(dòng)玻片，直至流下的液體無色為止，約需0.5min。 復(fù)染：水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色，1min。 水洗，用濾紙吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行鏡檢。 5鏡檢： 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽

8、性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。 。,注意事項(xiàng)：,酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時(shí)間要很好掌握。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時(shí)取菌要少，涂片薄而均勻?yàn)楹谩?被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會(huì)影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在1824h之內(nèi)。,革蘭氏染色方法操作步驟,涂片,生理 鹽水,接種環(huán),草酸銨結(jié)晶紫,碘 液,

9、95%乙醇,自然干燥,媒染1min,脫色0.5min,固定,初染1min,復(fù)染1min,干燥鏡檢,復(fù)紅,銅綠假單胞菌鏡下形態(tài)圖示：,氧化酶試驗(yàn),原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統(tǒng)扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細(xì)胞色素（reducedcytochrome）氧化，產(chǎn)生水或過氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實(shí)驗(yàn)有助于區(qū)分奈瑟氏菌屬（Neisseria）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽性(oxidasepositive)，與腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）此科之細(xì)菌為氧化酵素陰性（oxidas

10、enegative）。 方法： 白色濾紙片 取菌+1滴1% 二甲基對苯二胺 1530s 變紅色（+） 不變色（-）,實(shí)驗(yàn)三 結(jié)果觀察及報(bào)告,綠膿菌素實(shí)驗(yàn)：23個(gè)可疑菌落綠膿菌素培養(yǎng)基37 24h 35mL氯仿振蕩 提取液呈藍(lán)色取液體于一新試管+1mL1mol/L鹽酸 上層鹽酸內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性，不變色則為陰性。 硝酸鹽還原產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)：可疑菌落硝酸鹽蛋白胨水 37 24h 小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生為陽性，否則陰性。,明膠液化實(shí)驗(yàn)：可疑菌落穿刺接種于明膠培養(yǎng)基 37 24h 取出放冰箱1030min 呈溶解狀為陽性，不溶解則為陰性。 42生長實(shí)驗(yàn) ：可疑菌落普通瓊脂斜面42 24h銅綠假單胞菌生長，而近似的

11、熒光假單胞菌不能生長 。,結(jié)果判斷,氧化酶（+）綠膿菌素（+） 可報(bào)告檢出 典型或 可疑菌落 氧化酶（+）綠膿菌素（-） 明膠液化（+） 可報(bào)告檢出 硝酸產(chǎn)氣（+） 42 生長（+）,革蘭氏染色（Gram staining）:革蘭氏染色法是由丹麥醫(yī)生Gram于1884年創(chuàng)立，其簡要操作分初染媒染脫色復(fù)染。如果染色得當(dāng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)G+菌體呈藍(lán)紫色，G-菌體呈淺紅色。通過革蘭氏染色法可把所有細(xì)菌分兩在類。因此它是分類鑒定菌種的重要指標(biāo)。其染色機(jī)制：通過初染和媒染操作后，在細(xì)菌細(xì)胞的膜或原生質(zhì)體上染上了不溶于水的結(jié) 晶紫與碘的大分子復(fù)合物。革蘭氏染色陽性（Gram Positive）:革蘭氏陽性菌由于細(xì)胞壁厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊 密，故在用乙醇洗脫時(shí)，肽聚糖網(wǎng)孔會(huì)因脫水而明顯收縮，再加上它基本不含類脂，故用乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，因此結(jié)晶紫與 碘復(fù)合物仍牢牢阻留下其細(xì)胞壁內(nèi)，使其