定量PCR中_ct值的含義-pcrct值;

1、實時熒光定量pcr 實時熒光定量pcr技術(shù)于1996年由美國applied biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，它具有特異性更強、有效解決pcr污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。 一. 實時熒光定量pcr原理所謂實時熒光定量pcr技術(shù)，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。1. ct 值的定義在熒光定量pcr技術(shù)中，有一個很重要的概念 ct值。c代表cycle，t代表threshold，ct

2、值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。圖1. ct值的確定 2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定pcr反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 sdcycle 6-15 3. ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系1，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算

3、出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖2. 熒光定量標準曲線4. 熒光化學熒光定量pcr所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料2?，F(xiàn)將其原理簡述如下：1） taqman熒光探針：pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步。如圖3所示。圖3. taqman 熒光探

4、針工作原理2）sybr熒光染料：在pcr反應(yīng)體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與pcr產(chǎn)物的增加完全同步。二內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的意義1幾種傳統(tǒng)定量pcr方法簡介3：1）內(nèi)參照法：在不同的pcr反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在pcr產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板4。2）競爭法：選擇由突

5、變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化pcr產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)5。3）pcrelisa法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的pcrelisa法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的6。2內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是

6、終點檢測，即pcr到達平臺期后進行檢測，而pcr經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔pcr儀上做96次重復實驗，所得結(jié)果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。圖4. 相同模板在同一臺pcr儀上進行96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；ct值則極具重現(xiàn)性三內(nèi)標對熒光定量pcr的影響 1實時熒光定量pcr無需內(nèi)標實時熒光定量pcr技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟

7、件之中，通過對每個樣品ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量pcr無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：1）ct值的重現(xiàn)性pcr循環(huán)在到達ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的ct值是恒定的。（見圖4）2）ct值與起始模板的線性關(guān)系由于ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量pcr是一種采用外標準曲線定量的方法。2內(nèi)標對實時熒光定量pcr的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則pcr反應(yīng)變?yōu)殡p重pcr，雙

8、重pcr反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著7,8。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。美國texas大學的科研人員進行了外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方9。applied biosystems公司的7700型實時熒光定量pcr儀是全球公認的熒光定量pcr的金標準，可實現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲

9、線的方法，而不用內(nèi)標進行定量。綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量pcr是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域10,11,12,13。參考文獻1. higuchi r, fockler c, etal. kinetic pcr analysis: real-time monitoring of dna amplification reactions. biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.2. dna/rna real-time quantitative pcr

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16、信號作為熒光本底信號，熒光域值是pcr第315個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設(shè)定在 pcr擴增的指數(shù)期。ct值：表示每個pcr反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)?？v坐標代表ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。擴增曲線pcr過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)過程中實時熒光強度為縱坐標所做的曲線 判斷擴增曲線是否良好的指標主要有幾個方面：1、曲線拐點清楚，特別是低濃度