細(xì)胞技術(shù)b淋巴細(xì)胞分離技術(shù)_h

1、B 淋巴細(xì)胞分離技術(shù)一、 實驗原理膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是 B 細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，它既是 B 細(xì)胞識別抗原的受體，與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合；又是表面抗原，能與相應(yīng)的抗 Ig 的抗體結(jié)合，故可用熒光標(biāo)記的抗 Ig 抗體作免疫熒光鏡檢，以查出 B 淋巴細(xì)胞。由于 B 淋巴細(xì)胞在分化過程中最先出現(xiàn)SmIg，所以該法可以檢出全部 B 淋巴細(xì)胞。B 淋巴細(xì)胞表面最先出現(xiàn) IgM，以后相繼出現(xiàn)IgG、IgD、IgA 等表面免疫球蛋白。而金黃色葡萄球菌 A 蛋白(SPA)能與許多哺乳動物 IgG的 Fc 段發(fā)生結(jié)合，并且這種反應(yīng)也發(fā)生于膜表面的 IgG，所以亦可以用熒光標(biāo)記的 SPA 菌體(FITCS

2、PA)替代 FITC 抗IgG 檢測 SmIg 陽性 B 淋巴細(xì)胞，凡于 FITCSPA 結(jié)合的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，可見到 B 淋巴細(xì)胞表面或周圍布滿許多呈黃綠色熒光的菌體，即為 SmIg陽性細(xì)胞即為B 淋巴細(xì)胞?，F(xiàn)將熒光標(biāo)記 SPA 法介紹如下：二、實驗材料1 凍干熒光金黃色葡萄球菌 A 蛋白(FITCSPA)菌體試劑，用時按要求稀釋。2 pH 值 72 Hanks 液，含 5%小牛血清。3 淋巴細(xì)胞分層液，20時比重為 107700024 吸管、移液管、臺式離心機(jī)、載玻片、蓋玻片三、實驗步驟1、取肝素抗凝血 2ml，用 Hanks 液稀釋 12 倍，輕輕加入到裝有 3ml 淋巴細(xì)胞分層液

3、的試管中，20002500 r/min 水平離心 2025min，獲取淋巴細(xì)胞。2、用 pH 值 7.2Hanks 液洗 2 次，最終配成細(xì)胞數(shù)為 225106/ml 的淋巴細(xì)胞懸液。用pH 值 72Hanks 液稀釋FITCSPA 菌體試劑，然后將淋巴細(xì)胞液與等量的FITCSPA 菌體懸液混合，充分混勻后，放 4冰箱 30min。3、再用經(jīng) 37預(yù)熱的 Hanks 液(含 5%小牛血清)洗滌離心4、取沉淀細(xì)胞滴加在載玻片上，覆以蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。四、 結(jié)果觀察凡淋巴細(xì)胞表面粘附 5 個以上菌體細(xì)胞為 SmIg 陽性。一般先用暗視野計算熒光陽性細(xì)胞數(shù)，繼用明視野計算同一視野中淋巴細(xì)胞

4、總數(shù)。每份標(biāo)本至少計算 200 個淋巴細(xì)胞，并求出熒光陽性細(xì)胞百分率，同時按原血標(biāo)本中淋巴細(xì)胞的總數(shù)計算 B 淋巴細(xì)胞的絕對值。同時，每個B 淋巴細(xì)胞表面可帶有不同類別的 Ig，即 IgM、IgG、IgA 等，如果分別用單價熒光抗 Ig 血清染色，則可鑒定不同 Ig 的 B 淋巴細(xì)胞。但淋巴細(xì)胞數(shù)量的多少會影響檢出率。過多或過少時，除難以計數(shù)外，染色背景明暗不勻，著色與不著色的細(xì)胞難以區(qū)別，一般以225106/ml 細(xì)胞濃度為宜，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)不少于 95%。五、實驗分析此法特異性強(qiáng)，熒光亮度好，操作迅速簡便。加上試劑有商品供應(yīng)，可以使本法標(biāo)準(zhǔn)化。一般 SmIg 陽性的 B 淋巴細(xì)胞表面或周圍均可

5、布滿許多黃綠色熒光菌體，很少見到表面只粘附 23 個菌體細(xì)胞同時，每個B 淋巴細(xì)胞表面可帶有不同類別的 Ig，即 IgM、IgG、IgA等，如果分別用單價熒光抗 Ig 血清染色，則可鑒定不同 Ig 的 B 淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞數(shù)量的多少會影響檢出率。過多或過少時，除難以計數(shù)外，染色背景明暗不勻，著色與不著色的細(xì)胞難以區(qū)別，一般以 225106/ml 細(xì)胞濃度為宜，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)不少于95%。實驗注意事項當(dāng) SmIg 抗體發(fā)生結(jié)合時，由于抗血清為雙價，使SmIg 出現(xiàn)交聯(lián)現(xiàn)象，這種抗原與抗體結(jié)合物可連成斑點和帽狀，時間過長，帽狀結(jié)合物可脫落或被吞飲而消失，因此染色后，觀察時間不能超過 30min，或在染色時加疊氮鈉防止帽狀物形成或被吞飲。在滴片前要徹底去除游離的抗體，以避免假陽性結(jié)果備注異硫酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC 純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC 分子量為 389.4，最大吸收光波長為 490495nm，最大發(fā)射