流感的相關(guān)知識及實驗室檢測 嚴(yán)選課件

流感的相關(guān)知識及實驗室檢測,陳憲楷,2018.5.24,1,參考材料,C,流感病毒,2,參考材料,3,參考材料,流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。人類的流行性感冒病毒(influenza,簡稱流感），屬正粘液病毒科，分A（甲）、B（乙）、C（丙）三型，呈球形或絲狀，是一種造成人類及動物患流行性感冒的負(fù)鏈RNA病毒。,4,參考材料,流感病毒的基因組,RNA與NP構(gòu)成RNP,基因組由8個短的單鏈RNA構(gòu)成，包含11個基因，編碼11個蛋白：血凝素(HA),神經(jīng)氨酸酶(NA),核蛋白(NP),M1,M2，NS1,NS2（NEP：核輸出蛋白），PA,PB1（聚合酶基團(tuán)1),PB1-F2和PB2。,5,參考材料,NP（核蛋白）和MP基質(zhì)蛋白(M1)抗原性穩(wěn)定，具有型特異性，將流感分A（甲）、B（乙）、c（丙）三型,6,參考材料,甲乙型流感主要亞型,血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原結(jié)構(gòu)極易發(fā)生變異，有亞型的特異性，是甲型流感病毒分亞型的主要依據(jù),甲型流感命名通常會遵照HN的規(guī)則命名，H代表血凝素，可分為16個亞型；N代表神經(jīng)氨酸酶，有9個亞型。會季節(jié)性在人群中出現(xiàn)的亞型通常為H1，2和3，以及N1和2,根據(jù)乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分為B型(Yamagata)和B型(Victoria).,7,參考材料,根據(jù)國家流感中心報道，今年監(jiān)測到的流感病毒以甲型H1N1亞型和乙型（Yamagata）系為主，并且總體上甲型H1N1亞型的比例超過B（Yamagata）系。甲型H3N2亞型和B（Victoria）系以低水平共同流行。,我國流感流行現(xiàn)狀及亞型,不僅在中國，在歐洲一些國家和地區(qū)，今冬流行的流感病毒優(yōu)勢毒株是B型（Yamagata），這一毒株沉寂已久，普通人群對它的免疫基本缺失,8,參考材料,圖.中國流感病毒檢出率及其亞型分布,9,參考材料,流感的季節(jié)性流行,長江以南,長江以北,流感病毒在我國的活動規(guī)律南北存在明顯的差異。,高峰期,10,參考材料,1.流感患者2.隱性感染者,1.近距離飛沫傳播2.接觸傳播,流感的流行病學(xué),傳染源,傳播途徑,病毒變異快,65歲以上老年人、嬰幼兒、慢性病患者,反復(fù)感染,并發(fā)癥,11,參考材料,感染流感的一般臨床表現(xiàn)：,流感一般急性起病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱(可達(dá)39-40)，伴畏寒、寒戰(zhàn)、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、極度乏力、食欲減退等全身癥狀，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流涕，也可有嘔吐、腹瀉等癥狀。,一般來講，流感全身癥狀比普通感冒重。流感為自限性疾病，發(fā)病3-4天后體溫逐漸消退，全身癥狀好轉(zhuǎn)。重癥病例可導(dǎo)致慢性基礎(chǔ)病加重，也可出現(xiàn)病毒性肺炎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等并發(fā)癥。,12,參考材料,13,參考材料,流感病毒的實驗室檢測,采集標(biāo)本類型：常規(guī)特殊咽拭子鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液、含漱液血清呼吸道灌洗液,實驗前處理,流感標(biāo)本采集采集時間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集，最好是24h內(nèi),14,參考材料,咽拭子采集,咽拭子用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。注意：采樣前1h內(nèi)不要進(jìn)食和飲水，采樣液中嚴(yán)禁加入抗生素,15,參考材料,標(biāo)本的處理和保存,標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妫Ｓ玫牟蓸右河校篜H7.4-7.6的Hanks液或MEM,標(biāo)本應(yīng)在4保存24小時內(nèi)送至實驗室，實驗室對收到的標(biāo)本最好2448小時內(nèi)進(jìn)行檢測或接種。,如不能在48h內(nèi)檢測或接種，標(biāo)本應(yīng)置于-70保存,16,參考材料,實驗室生物安全要求,季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級實驗室進(jìn)行。,用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測時可以在生物安全級實驗室進(jìn)行,流感病毒分離鑒定及其它檢測過程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過程必須在生物安全級實驗室的生物安全柜里操作。,17,參考材料,常見的流感病毒實驗室檢測方法,18,參考材料,19,參考材料,季節(jié)性流感檢測流程,臨床標(biāo)本采集,接種MDCK細(xì)胞,接種雞胚,紅細(xì)胞凝集抑制試驗，鑒定病毒,紅細(xì)胞凝集試驗,流感病毒核酸檢測陽性,PCR鑒定,20,參考材料,21,參考材料,流感病毒亞型的鑒定,22,參考材料,流感病毒亞型的鑒定流程,紅細(xì)胞凝集試驗,4個凝集單位配制“回滴”,紅細(xì)胞凝集抑制試驗,判定流感病毒型別,23,參考材料,紅細(xì)胞凝集試驗（HA）,MDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗（HA），確定病毒滴度,原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能結(jié)合并識別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn),24,參考材料,25,參考材料,A,H,B,C,D,E,F,G,100ul病毒液,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液,50ulPBS,稀釋病毒加入配制好的紅細(xì)胞懸液充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果,操作簡圖,26,參考材料,病毒原液,1:2,1:128,HA:32,HA128,HA:4,27,參考材料,紅細(xì)胞凝集試驗（HA）結(jié)果判讀,HA滴度8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗；,若傳12代后，HA滴度仍8者，可應(yīng)用核酸檢測方法進(jìn)行鑒定,HA滴度60歲、體溫在38.038.9之間，流感病毒陽性檢出率高于其他組；,參考文獻(xiàn)李珺，劉亞楠，田國保等.臨床實驗室流感病毒檢測的相關(guān)影響因素分析J.國際病毒學(xué)雜志,2017，24（5）：331-335ISTIC張杰，武晶晶等.不同溫度和不同放置時間對總RNA提取濃度和純