DNA與基因芯片.ppt

,第二十一章,基因診斷與基因治療GeneticDiagnosisandGeneTherapy,基因變異致病類型,內(nèi)源基因的變異：基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常,外源基因的入侵：,基因診斷和基因治療,遺傳性疾病,腫瘤、心腦血管病等,（生殖細(xì)胞）,（體細(xì)胞）,病毒感染性疾?。篐IV、SARS、HCV、HPV,第一節(jié)基因診斷GeneticDiagnosis,特點(diǎn)：針對性強(qiáng)：病因?qū)W檢測特異性強(qiáng)：分子雜交技術(shù)靈敏度高：PCR、分子雜交放大效應(yīng)，樣品量少適應(yīng)性強(qiáng)：內(nèi)源、外源基因早期快速診斷：,一、基因診斷的概念和特點(diǎn),定義：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。,二、基因診斷常用技術(shù)方法,（一）核酸分子雜交技術(shù),（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（三）基因測序（四）基因芯片,二、基因診斷常用技術(shù)方法,限制性內(nèi)切酶譜分析法DNA限制性長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)間接分析,（一）核酸分子雜交技術(shù),核酸分子雜交技術(shù)原理：,核酸分子雜交的流程示意圖,待測核酸制備,濾膜上核酸固化,雜交,去除未參與雜交的探針,檢測雜交信號,制備探針核酸片段,探針標(biāo)記,加入標(biāo)記核酸探針,Mst酶切位點(diǎn)(GCTNAGG),5,3,正常基因,突變基因,1.15kb,1.35kb,1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,0.2kb,正常珠蛋白基因：5CCTGAGG3,鐮刀型貧血：5CCTGTGG3,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突變攜帶著,患者,1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,DNA多態(tài)性：中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異限制性長度多態(tài)性分析：突變發(fā)生在酶切位點(diǎn)上，酶切DNA片段不同長度RFLP：孟德爾方式遺傳，家族中，與某一疾病緊密連鎖，作為遺傳標(biāo)志，判定家族成員是否攜帶致病基因應(yīng)用：甲型血友病、囊性纖維病變、苯丙酮尿癥,2.DNA限制性長度多態(tài)性分析,RLFP分析法,單基因病-苯丙酮尿癥I型,病因：肝臟合成的苯丙氨酸羥化酶（PhenylalaninaHydrozylase,PAH）缺乏。主征：智力低下，尿有霉味治療：新生兒診斷明確后，即用低苯丙氨酸飲食控制血中苯丙氨酸濃度，改善腦子的發(fā)育，而“危險(xiǎn)期”一過，病嬰后來就基本正常。,PAH僅存在于肝臟細(xì)胞中，在絨毛、羊水細(xì)胞和胎兒血中均不表達(dá)，故不能通過測定酶活力及代謝產(chǎn)物來進(jìn)行PKU的產(chǎn)前診斷只能依賴于家系分析，找出與PKU致病基因相連鎖的RFLP，進(jìn)行基因分析做出產(chǎn)前診斷,（二）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreactionPCR）,PCR定義：指由一對引物介導(dǎo)的基因或克隆的特定DNA序列的酶促擴(kuò)增的反應(yīng)過程，是DNA的體外擴(kuò)增技術(shù)，本質(zhì)是DNA的體外復(fù)制。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的23小時擴(kuò)增至百萬倍。,（二）聚合酶鏈反應(yīng),KaryMullisresearchscientistinthe1980sataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetusco-winnerof1993NobelPrize,PCR技術(shù)的基本原理,模板DNA的變性：94熱變性，使DNA雙鏈解離成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2n(n為循環(huán)次數(shù)),以愛滋病的臨床檢測為例，簡要說明一下PCR在病毒感染的基因診斷中的應(yīng)用。,組織中總RNA的提取利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNAPCR反應(yīng)：反應(yīng)緩沖液模板（上述合成的cDNA）底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物（愛滋病病毒特異性引物）TaqDNA聚合酶50l循環(huán)：95，30sec（變性）55，1min（退火）30循環(huán)72，1min（延伸）,（三）基因測序技術(shù),他們給DNA的測序帶來了一場革命，分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎。后來Sanger法發(fā)展為自動化測序法，并為人類基因組測序做出了卓越貢獻(xiàn)。,FredSanger發(fā)明的末端合成終止法(sanger法),WalterGilbert發(fā)明的化學(xué)裂解法Maxam-Gillbert法,末端合成終止法(sanger法)原理,2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）與普通dNTP不同之處在于其脫氧核糖的3位置少一個羥基，可在DNA聚合酶作用下通過其5三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但ddNTP因缺乏3羥基而不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，當(dāng)正在增長的DNA鏈末端堿基為ddNTP時，則鏈延伸反應(yīng)終止，不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離，結(jié)果將產(chǎn)生4類寡核苷酸，它們分別終止于模板鏈的每一個A、C、G或T的位置上。,雙脫氧鏈終止法的測序基礎(chǔ)是以雙脫氧核苷三磷酸為循環(huán)測序反應(yīng)的鏈終止劑。,P,OH,dNTP,ddNTP,P,OH,OH,P,P,P,P,OH,末端合成終止法(sanger法)原理,5,3,5,3,引物,模板DNA,dNTPDNA聚合酶,ddATP,ddTTP,ddGTP,ddCTP,末端合成終止法(sanger法)原理,末端合成終止法(sanger法)原理,DNA自動測序結(jié)果,（四）基因芯片技術(shù),快速、高通量、平行化、自動化,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量基因探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）,（四）基因芯片技術(shù),1.芯片的制備,Geneprobes（cDNA、DNA）,Ready-to-usemicroarray,or,arrayer,Samplecells,ExtractRNAorDNA2)RTorPCRamplification3)Fluorescentlabeling,Referencecells,Sampleready,combine,LabeledRNAorDNA(Sample),LabeledRNAorDNA(Reference),2),1),3),1),2),3),2.基因表達(dá)譜雙色標(biāo)記,3.分子雜交,1)hybridize,Applysample,2)rinse,4.檢測分析,Laser1,Laser2,Detector1,Detector2,芯片的掃描,5.圖像處理,Detector1,Detector2,False-colordifferentialimage,圖像分析,基因診斷方法,經(jīng)典基因診斷.限制性內(nèi)切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法,優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn),.特異基因診斷.未知基因診斷.直接，過程簡單,.過程繁雜.準(zhǔn)確性低，過程繁.條件嚴(yán)格,基因診斷進(jìn)展.PCR方法.PCR-序列分析法.DNA芯片技術(shù),.簡單、經(jīng)濟(jì)、敏感.操作直接、準(zhǔn)確.集成度高、快速、并行,.假陽性高.價(jià)格高.尚無成熟產(chǎn)品問世,三、基因診斷的應(yīng)用,遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定,小結(jié),基因診斷的定義基因診斷的特點(diǎn)基因診斷的常用技術(shù),第二節(jié)基因治療GeneTherapy,定義早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。,目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。,一、基因治療的概念,基因治療的基本方法基因矯正(genecorrection)基因置換(genereplacement)基因增補(bǔ)(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation),幾種常見的基因失活技術(shù),反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù),基因治療的其他方法：如“自殺基因”的應(yīng)用，基因疫苗等,二、基因治療的基本程序,治療性基因的