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文檔簡介

PCR反應(yīng)原理及其操作,精選,2,1.PCR的基本原理2.PCR反應(yīng)體系3.PCR的基本步驟,精選,3,PCR的基本原理,試管中進行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。,精選,4,PCR反應(yīng)體系,4種dNTP混合物各200umol/L（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L,精選,5,PCR的基本步驟,1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。2.退火（復(fù)性）（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。,精選,6,精選,7,精選,8,高溫變性,精選,9,低溫退火,精選,10,中溫延伸,精選,11,精選,12,精選,13,在引物作用下，Taq酶從引物3端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5端自3端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3端延伸DNA鏈。,精選,14,PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進行，可使目的DNA得以迅速擴增。,精選,15,理論擴增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），2530循環(huán)，目標DNA可增加109倍。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性

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