全國生物學(xué)競賽：第八章《菌種的保藏》輔導(dǎo)課件(8).ppt

第八章菌種的保藏,第一節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯一、菌種的衰退二、菌種的復(fù)壯第二節(jié)菌種的保藏一、菌種保藏的目的二、菌種保藏的原理三、菌種保藏的方法,性狀穩(wěn)定的菌種是微生物工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。,影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染；c）死亡,第一節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯,在微生物的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中，選育一株理想的菌株是一件艱苦的工作，而欲使菌種始終保持優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性，便于長期使用，還需要做很多日常的工作。實(shí)際上，由于各種各樣的原因，要使菌種永遠(yuǎn)不變是不可能的，菌種衰退是一種潛在的威脅。只有掌握了菌種衰退的某些規(guī)律，才能采取相應(yīng)的措施，盡量減少菌種的衰退或使已衰退的菌種得以復(fù)壯。,一、菌種的衰退,菌種衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。,純菌種,自發(fā)突變,突變個(gè)體,傳代增殖,原始個(gè)體,不純菌種,衰退菌種,（一）菌種衰退的現(xiàn)象,菌落和細(xì)胞形態(tài)改變生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負(fù)突變致病菌對宿主侵染能力下降對外界不良條件的抵抗能力下降等,（二）菌種衰退的原因,基因突變主要原因1、有關(guān)基因發(fā)生負(fù)突變導(dǎo)致菌種衰退2、表型延遲造成菌種衰退3、質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退連續(xù)傳代加速衰退不適宜的培養(yǎng)和保藏條件加速衰退,（三）菌種衰退的防止,控制傳代次數(shù)創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件利用不易衰退的細(xì)胞移種傳代采用有效的菌種保藏方法講究菌種選育技術(shù)定期進(jìn)行分離純化,二、菌種的復(fù)壯,狹義的復(fù)壯消極的措施是指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。,廣義的復(fù)壯積極的措施是指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。,菌種復(fù)壯的主要方法,純種分離法,菌落純（“菌種純”）,細(xì)胞純（“菌株純”）,通過純種分離,可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。,宿主體內(nèi)復(fù)壯法對于寄生性微生物的衰退菌株，可通過接種到相應(yīng)昆蟲或動植物宿主體內(nèi)來提高菌株的毒性。,淘汰法將衰退菌種進(jìn)行一定的處理（如藥物、低溫、高溫等），往往可以起到淘汰已衰退個(gè)體而達(dá)到復(fù)壯的目的。,遺傳育種法把退化的菌種重新進(jìn)行遺傳育種，從中再選出高產(chǎn)而不易退化的穩(wěn)定性較好的生產(chǎn)菌種。,第二節(jié)菌種的保藏,菌種是重要的生物資源，研究和選擇良好的菌種保藏方法具有重要的意義。,一、菌種保藏的目的,菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達(dá)到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。,二、菌種保藏的原理,首先應(yīng)該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進(jìn)行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。,其次應(yīng)人為地創(chuàng)造環(huán)境條件（如：干燥、低溫和缺氧），使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。,盡可能多的采用不同的手段保藏一些比較重要的微生物菌株,三、菌種保藏方法,各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。,斜面低溫保藏法石蠟油封藏法砂土管保藏法麩皮保藏法甘油懸液保藏法冷凍真空干燥保藏法液氮超低溫保藏法宿主保藏法,（一）斜面低溫保藏法常用保藏法,將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。,此法廣泛適用于各大類微生物菌種的短期保藏此法的主要保藏措施是低溫。一般可保存16個(gè)月左右。優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，容易推廣，存活率高；缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。,（二）石蠟油封藏法,此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。,此法廣泛適用于各大類微生物菌種的中期保藏不適用于保藏某些能分解烴類的菌種。此法的主要保藏措施是低溫、阻氧。一般可保存12年左右。,（三）砂土管保藏法,一種常用的長期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細(xì)菌，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌及酵母則不適用。,砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡便。它的保藏期約110年。,該法是將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，121蒸汽滅菌11.5h，間歇滅菌3次。50烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約24h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。,（四）麩皮保藏法,又稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是，將麩皮與水以一定的比例拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。,此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。,（五）甘油懸液保藏法,此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用20，保藏期約為0.51年，而采用70，保藏期可達(dá)10年。,將擬保藏菌種對數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在1015，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏?；蚬こ叹２捎帽痉ū２亍?（六）冷凍真空干燥保藏法,又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即熔封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。,此法適用于各大類微生物。此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護(hù)劑，保藏期一般長達(dá)515年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。,（七）液氮超低溫保藏法,簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（196）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。,此法適用于各種微生物菌種的保藏。此法的主要保藏措施是超低溫、有保護(hù)劑，保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。其缺點(diǎn)是需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。,（八）宿主保藏法,此法適用于專性活細(xì)胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。,植物病毒可用植物幼葉的汁液與病毒混合，冷凍或干燥保存。噬菌體可以經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)大后，與培養(yǎng)基混合直接保存。動物病毒可直接用病毒感染適宜的臟器或體液，然后分裝于試管中密封，低溫保存。,在上述的菌種保藏方法中，以斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、宿主保藏法最為簡便；砂土管保藏法、麩皮保藏法