維生素的測(cè)定VIP

5.7維生素的測(cè)定,概述脂溶性維生素A、E的測(cè)定水溶性維生素B、C的測(cè)定,5.7.1概述,（1）維生素的分類(lèi)及生理功能（2）測(cè)定的目的和意義（3）維生素的測(cè)定方法,1、維生素的分類(lèi)及生理功能,功能：維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類(lèi)小分子有機(jī)化合物。它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類(lèi)多，目前已經(jīng)確認(rèn)的有30多種，其中有20種被認(rèn)為與維持人體健康和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的。維生素的主要功能是通過(guò)作為輔酶的成分調(diào)節(jié)代謝過(guò)程，人體對(duì)它的需要量極少，但作用非常大。它一般在體內(nèi)不能合成或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝?。婚L(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)新陳代謝的紊亂，出現(xiàn)各種特有的癥狀。,分類(lèi)：按維生素溶解性能可將它們分成兩大類(lèi)：一類(lèi)是能溶在脂肪或脂溶性溶劑中的，叫脂溶性維生素（如A、D、E、K等）；另一類(lèi)是能溶解在水中的，叫水溶性維生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。,2、測(cè)定的目的和意義,多數(shù)維生素的性質(zhì)是不穩(wěn)定的，對(duì)光、氧、熱、PH等非常敏感，食物在加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等一系列環(huán)節(jié)都可能造成維生素的損失。為了彌補(bǔ)這種損失，維生素常常作為強(qiáng)化劑在食品工業(yè)的某些產(chǎn)品中使用。,意義：（1）可評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；（2）開(kāi)發(fā)利用富含維生素的食品；（3）可以研究食品在不同的加工、儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)而指導(dǎo)人們制定合理的工藝條件，減少維生素的損失；（4）起到監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的劑量，以防攝入過(guò)多的維生素而引起中毒。,3、維生素的測(cè)定方法微生物法：基于某種微生物生長(zhǎng)需要特定的維生素，方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需要特殊儀器，樣品不需經(jīng)特殊處理，但只能測(cè)定水溶性維生素?；瘜W(xué)法：比色法、滴定法儀器法：色譜法、熒光法、酶法、免疫法等。特別是HPLC可用于大多數(shù)維生素的測(cè)定，并且在某些條件下可同時(shí)分析幾種維生素，但分析費(fèi)用較高。應(yīng)根據(jù)不同的食品基質(zhì)和條件選擇不同的分析方法,重點(diǎn)講解的方法：高效液相色譜法（HPLC法）同時(shí)測(cè)定脂溶性維生素A和維生素E比色法測(cè)定維生素AHPLC法測(cè)定胡蘿卜素?zé)晒夥y(cè)定B1、B2滴定法和比色法測(cè)定維生素C,5.7.2維生素A、E的測(cè)定（HPLC法）,VA的性質(zhì)：維生素A是-紫羅酮環(huán)與一元醇所組成的一類(lèi)化合物及其衍生物的總稱(chēng)。通常所說(shuō)的維生素A是指視黃醇或視黃醇醋酸酯。因有許多不飽和鏈，故見(jiàn)光易分解；在缺氧情況下，對(duì)熱較穩(wěn)定，對(duì)光特別敏感。如測(cè)強(qiáng)化奶粉時(shí)，速度要快，一般要求測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)短，因?yàn)闀r(shí)間長(zhǎng)，見(jiàn)光時(shí)間長(zhǎng)，見(jiàn)光分解，故測(cè)出的比出廠的含量要少；不溶于水，溶于有機(jī)溶劑，對(duì)堿穩(wěn)定；,VE的性質(zhì)：又稱(chēng)生育酚，目前已經(jīng)確認(rèn)的有8種異構(gòu)體，最常見(jiàn)的有、-生育酚。溶于脂溶性溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，酸性環(huán)境中比堿性環(huán)境中穩(wěn)定，無(wú)氧條件下，對(duì)熱、光及堿性環(huán)境中也相對(duì)穩(wěn)定。VE廣泛分布在各種糧食的胚和植物油中。,測(cè)定原理：（1）液相色譜的原理：液相色譜是采用液體為流動(dòng)相的一種色譜法。高效液相色譜儀由高壓泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、記錄和數(shù)據(jù)處理裝置等部分組成。高壓泵以恒定的流量，從貯液容器吸取作為流動(dòng)相的溶劑輸送到色譜柱，試樣由進(jìn)樣裝置導(dǎo)入，隨流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離。分離后的組分進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)，并用記錄儀繪出色譜圖，或與其他數(shù)據(jù)處理裝置相連，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理色譜圖：某一波長(zhǎng)下各個(gè)不同時(shí)刻的吸光度值描點(diǎn)作圖。,（2）高效液相色譜檢測(cè)樣品中的維生素A、E的原理：樣品中的維生素E及維生素A經(jīng)皂化提取處理后，將其從不皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生E和維生素A分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法定量,（3）什么是內(nèi)標(biāo)法？取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規(guī)定的定量?jī)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱，根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高的比例為縱坐標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比或標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液，調(diào)制試樣液時(shí)，預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的同樣條件下得出色譜圖，求出被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高之比，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)求出被測(cè)成分的含量。內(nèi)標(biāo)物的選取原則：能與被測(cè)成分完全分離，但其保留時(shí)間又盡可能接近被測(cè)成分的穩(wěn)定的物質(zhì)。,試劑（1）無(wú)水乙醚：不含有過(guò)氧化物。（2）無(wú)水乙醇：不得含有醛類(lèi)物質(zhì)。（3）無(wú)水硫酸鈉。（4）甲醇：重蒸后使用。（5）重蒸水：水中加少量高錳酸鉀，臨用前蒸餾。（6）抗壞血酸溶液（100gL）：臨用前進(jìn)行配制。（7）氫氧化鉀溶液（50g100g）：取50g氫氧化鉀,溶于50g水中，混勻,標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（1）維生素A標(biāo)準(zhǔn)液：視黃醇（純度85）或視黃醇乙酸酯（純度90）經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。（2）維生素E標(biāo)準(zhǔn)液：a-生育酚（純度95），-生育酚（純純95），-生育酚（純度95）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL,臨用前用紫外分光光度法分別標(biāo)定此三種維生素E的準(zhǔn)確濃度。（3）內(nèi)標(biāo)溶液：稱(chēng)取苯并芘（純度98），用脫醛乙醇配制成10ug/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。,儀器和設(shè)備（1）高效液相色譜儀帶紫外分光檢測(cè)器。（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。（3）高速離心機(jī)（帶小塑料離心管）（4）高純氮?dú)?。?）紫外分光光度計(jì)。,樣品處理（1）皂化：稱(chēng)取適量樣品（含維生素A約3g，維生素E各異構(gòu)體約40g）于三角瓶中，加30mL無(wú)水乙醇，振搖使樣品分散。加入5mL100gL抗壞血酸溶液和2.0mL苯并芘內(nèi)標(biāo)液，混勻，加10mL氫氧化鉀溶液（50濃度），混勻，于沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷卻。思考：1、皂化時(shí)加入Vc的作用是什么？,（2）提取：將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL無(wú)水乙醚分2次洗皂化瓶及殘?jiān)颐岩翰⑷敕忠郝┒分?。輕輕振搖2min，靜置分層，棄去水層。然后每次用約50mL水將乙醚液洗至中性，需洗45次,（3）濃縮：將乙醚提取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉（約5g）濾入150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，用約15mL乙醚沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，于55水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，醚剩下約2mL時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，用氮?dú)獯蹈梢颐眩S即加人2mL乙醇，充分混合，溶解提取物。將乙醇液移人塑料離心管中，于離心機(jī)上離心5min（5000rmin），上清液供色譜分析用。,液相色譜推薦條件：分析柱：C18反相柱5m，4.6mmX25Cm；流動(dòng)相：甲醇：水=98：2，混勻，臨用前脫氣；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：300nm;進(jìn)樣量：20L；流速：1.70mL/min。,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（1）.維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：取上述配制的維生素A、E的標(biāo)準(zhǔn)溶液按一定的倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)谙卤硪蟮臈l件下測(cè)定其吸光度，根據(jù)其吸光系數(shù)計(jì)算其準(zhǔn)確濃度。,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算：p-某維生素濃度，mgmL；A-維生素的平均紫外吸光值；E-某種維生素l比吸光系數(shù);F-稀釋倍數(shù)。,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。把高、低兩個(gè)濃度的維生素A、-生育酚、a-生育酚、-生育酚及內(nèi)標(biāo)苯并芘液混合，（其內(nèi)標(biāo)苯并芘的濃度值相同）將二種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)色譜圖。以維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，維生素的濃度(ug/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,樣品分析：取樣品處理液20L，用標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的條件進(jìn)行色譜分析，繪制色譜圖。定性：根據(jù)保留時(shí)間定性定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此比值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)維生素的含量。,計(jì)算：式中：X某種維生素的含量，mg100g；p由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的某種維生素含量，g/mL；V樣品濃縮后定容體積，mL；m樣品質(zhì)量，g。,說(shuō)明及討論（1）維生素極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，或使用棕色玻璃儀器。（2）乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過(guò)猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。（3）本法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，適用于各種食物和飼料中維生素A和維生素E的同時(shí)測(cè)定。（4）本法不能將-生育酚-生育酚分開(kāi)，所以-生育酚的色譜峰中含有-生育酚。,（5）維生素的含量可用國(guó)際單位（IU）表示：1國(guó)際單位（IU）=0.3ug維生素A=1mg維生素E=0.025ug維生素D,5.7.3維生素A的測(cè)定（三氯化銻比色法）原理：VA+三氯化銻藍(lán)色物質(zhì)，于620nm測(cè)吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。試劑：無(wú)水Na2SO4、乙酸酐：吸水乙醚：抽提乙醇、KOH：皂化反應(yīng)三氯甲烷：溶劑三氯化銻-三氯甲烷：反應(yīng)試劑酚酞：用于鑒別洗滌液中有無(wú)堿,步驟：（1）預(yù)處理：皂化、提取、洗滌、濃縮（2）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：用VA標(biāo)準(zhǔn)液繪制，用CHCl3調(diào)零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測(cè)定(3)樣品測(cè)定：用樣品溶液代替標(biāo)準(zhǔn)液溶液。,說(shuō)明(1)萃取時(shí),不要用力過(guò)猛,避免發(fā)生乳化。（2）氯仿中必須無(wú)水，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)沉淀，干擾比色測(cè)定。（3）由于三氯化銻與VA所產(chǎn)生的蘭色物質(zhì)不穩(wěn)定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測(cè)定。（4）三氯化銻腐蝕性強(qiáng)，且遇水生成白色沉淀，實(shí)驗(yàn)用過(guò)的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。,5.7.4、-胡蘿卜素的測(cè)定（HPLC法）,試樣中的-胡蘿卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，經(jīng)三氧化鋁柱純化，然后以高效液相色譜法測(cè)定，以保留時(shí)間定性，以峰高或峰面積定量。注意：濃縮提取液時(shí)，防止蒸干，避免胡蘿卜素在空氣中氧化或因高溫、紫外線直射等破壞。,5.7.5、維生素B1的測(cè)定熒光法,原理：硫胺素（VB1）在堿性鐵化鉀溶液中被氧化為嘧噻色素，在紫外線照射下，嘧噻色素發(fā)出熒光。在給定條件下，以及沒(méi)有其他熒光物質(zhì)干擾時(shí)，熒光強(qiáng)度與嘧噻色素成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。試樣在硫酸作用下,加熱提取VB1.冷卻后用淀粉酶在pH=4.5時(shí)處理使VB1分離如果樣品中含雜質(zhì)過(guò)多，應(yīng)經(jīng)離子交換劑處理，使硫胺素與雜質(zhì)分離，然后以所得溶液做測(cè)定。測(cè)定步驟：提取凈化氧化測(cè)定加入淀粉酶的作用:使結(jié)合態(tài)VB1變?yōu)橛坞x態(tài)VB1.,5.7.6、維生素B2的測(cè)定熒光法,原理：試樣在稀鹽酸中水解、酶解，調(diào)整PH值，過(guò)濾除去蛋白質(zhì)等物質(zhì)；試樣溶液經(jīng)高錳酸鉀氧化，除去干擾物，再經(jīng)硅鎂吸附劑的柱層析，提純的核黃素在波長(zhǎng)525nm下發(fā)生黃綠色熒光，在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。再加入低亞硫酸鈉，將VB2還原成無(wú)熒光的物質(zhì)，然后再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光，兩者相差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。測(cè)定核黃素的方法還有：微生物法和HPLC法。,討論：P202思考題：1、3、4,5.7.7維生素C（抗壞血酸）的測(cè)定,維生素C的生理功能及性質(zhì)維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱(chēng)作抗壞血酸。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱(chēng)為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂(lè)糖酸，失去生理作用。在食品中，這三種形式均有存在，但主要是前兩者，故許多國(guó)家的食品成分表均以抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量表示。,維生素C為白色至淺黃色晶體或結(jié)晶性粉末，受光照則逐漸變褐，干燥狀態(tài)下相當(dāng)穩(wěn)定，但在空氣存在下于溶液中則迅速變質(zhì)。還原型維生素C有強(qiáng)還原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化劑。在新鮮的水果蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、獼猴桃、柑橘等食品中含量尤為豐富。,維生素C的測(cè)定方法維生素C的測(cè)定方法有：2，6-二氯靛酚滴定法、2，4二硝基苯肼比色法、熒光法、高效液相色譜法。（1）2，6-二氯靛酚滴定法測(cè)定的是還原型抗壞血酸，該方法簡(jiǎn)便、靈敏，但特異性差，樣品中的其他還原性物質(zhì)（如鐵離子、銅離子等）會(huì)干擾測(cè)定，使結(jié)果偏高，對(duì)色深樣液的滴定終點(diǎn)不易辨別。,（2）2，4二硝基苯肼比色法和熒光法測(cè)得的是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。苯肼法操作復(fù)雜，特異性差，易受共存物質(zhì)的影響；熒光法受干擾的影響較小，結(jié)果較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜。（3）高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量，具有干擾少，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，靈敏、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是上述幾種方法中最先進(jìn)、可靠的方法。但分析成本較高。主要介紹維生素C常用的測(cè)定方法2，6-二氯靛酚滴定法、苯肼比色法,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,原理：還原型抗壞血酸可以還原染料2，6-二氯靛酚。該染料在酸性溶液中是粉紅色（在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色），被還原后顏色消失；還原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒(méi)有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)染料液的量，與樣品中抗壞血酸含量成正比。,試劑1%草酸溶液（m/V）2%草酸溶液（m/V）抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2，6-二氯靛酚溶液0.001molL碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱(chēng)取干燥的碘酸鉀0.3567g，用水稀釋至100ml，取出1mL，用水稀至100mL，此溶液1mL相當(dāng)于抗壞血酸0.088mg。1%淀粉溶液（m/V）6%碘化鉀溶液（m/V）,抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定：配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取20mg抗壞血酸，溶于1的草酸中，并稀釋至100ml，置冰箱中保存。用時(shí)取出5mL，置于50mL容量瓶中，用1草酸溶液定容，配成0.02mg/mL的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)定：吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液5mL于三角瓶中，加入6碘化鉀溶液0.5mL、1淀粉溶液3滴，以0.00lmol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點(diǎn)為淡藍(lán)色。,C抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/mL；V1滴定時(shí)消耗0.001molL碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2滴定時(shí)所取抗壞血酸的體積，mL；0.088lmL0.001mol碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于抗壞血酸的量，mgmL一般抗壞血酸純度為99.5%以上，可不標(biāo)定，但要現(xiàn)用現(xiàn)配,2.22，6-二氯靛酚溶液的配制和標(biāo)定配制：稱(chēng)取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，待冷，置于冰箱中過(guò)夜。次日過(guò)濾于250mL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期標(biāo)定1次。標(biāo)定：取5mL已知濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1草酸溶液5mL，搖勻，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色，在15s不褪色為終點(diǎn)。,計(jì)算:式中：T每毫升染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)，mgmL；c抗壞血酸的濃度，mgmL；V1抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2消耗2，6-二氯靛酚的體積，mL,測(cè)定步驟,提取:鮮樣的制備:稱(chēng)100g鮮樣，加等量的2草酸溶液，倒入組織搗碎機(jī)中打成勻漿。取1040g勻漿于100mL容量瓶?jī)?nèi)，用1草酸稀釋至刻度，混合均勻。干樣的制備:稱(chēng)14g干樣放入乳缽內(nèi)加l草酸溶液磨成勻漿，倒入100ml容量瓶中，用1草酸稀釋至刻度。過(guò)濾上述樣液，不易過(guò)濾的可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液過(guò)濾備用。,滴定：吸取510mL濾液，置于50mL三角瓶中，快速加入2,6-二氯靛酚溶液滴定，直到紅色不能立即消失，而后再盡快地一滴一滴的加入（樣品中可能存在其他還原性雜質(zhì)，但一般雜質(zhì)還原染料的速度均比抗壞血酸慢），以呈現(xiàn)的粉紅色在15s內(nèi)不消失為終點(diǎn)。同時(shí)做空白。,結(jié)果計(jì)算式中：x-樣品中抗壞血酸含量，mg100g；T-1mL染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mgmL；A稀釋倍數(shù)V-滴定樣液時(shí)消耗染料的體積，mL；V0-滴定空白時(shí)消耗染料的體積，mL；m-樣品的質(zhì)量，g。,說(shuō)明,所有試劑最好用重蒸餾水配制。樣品采取后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止維生素C氧化損失。測(cè)定時(shí)整個(gè)操作過(guò)程要迅速，防止抗壞血酸被氧化。若測(cè)動(dòng)物性樣品，須用10%三氯乙酸代替2%草酸溶液提取。若樣品濾液顏色較深，影響滴定終點(diǎn)觀察，可加入白陶土再過(guò)濾，過(guò)濾后要迅速滴定。若樣品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等還原性雜質(zhì)時(shí)，會(huì)使結(jié)果偏高。,（二）2，4二硝基苯肼比色法,原理總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂(lè)糖酸，樣品中還原型抗血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-二硝基苯肼生成紅色的脎，在濃硫酸的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色的無(wú)水化合物雙-2，4-二硝基苯，在濃硫酸中顯色穩(wěn)定，吸光度的大小與總抗壞血酸含量成比，進(jìn)行比色定量。,操作過(guò)程：樣品處理氧化呈色硫酸處理比色數(shù)據(jù)處理（1）樣品制備：同2，6-二氯靛酚滴定法（2）氧化處理：取25mL上述濾液，加入2g活性炭，振搖lmin，過(guò)濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10mL此氧化提取液，加入10mL20g/L的硫脲溶液，混勻。,（3）呈色反應(yīng)：于三個(gè)試管中各加入4mL經(jīng)氧化的樣品稀釋液,一個(gè)試管作為空白，在其余試管中加入1.0mL20gL2，4-二硝基苯肼溶液，將所有試管放入（37士0.5）恒溫箱或水浴中，保溫3h。3h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠芾涞绞覝兀缓蠹尤?.0mL20gL2,4-二硝基苯肼溶液，在室溫中放置1015min后放入冰水內(nèi)。其余步驟同樣品。,（4）硫酸（91）處理當(dāng)試管放入冰水后，向每一試管中加入5mL硫酸（9十1）滴加時(shí)間至少需要1min，（防止溶液溫