《基因工程的應(yīng)用》PPT課件

第十章基因工程的應(yīng)用,第一節(jié)基因誘變,一、蛋白質(zhì)工程,通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白動(dòng)力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上對(duì)編碼該蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計(jì)改造，并通過基因工程將其表達(dá)和純化，最終投入實(shí)際應(yīng)用。,專一改變基因中某一個(gè)或某些特定氨基酸的技術(shù)。,二、定點(diǎn)突變（site-specificmutagenesis）,加拿大科學(xué)家MichaelSmith1985年建立，并與1993年獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。,1.M13DNA進(jìn)行的寡核苷酸介導(dǎo)誘變,（1）條件,所要改變的基因編碼區(qū)的精確的核苷酸序列。,所要引入的氨基酸變化。,（2）方法,取得目的基因。,GGCTTA,CCGAAT,5,5,3,3,插入到雙鏈形式的M13噬菌體載體中,分離出M13正鏈重組載體,GGCTTA,CCGAATGGCTTA,合成帶有突變核苷酸的目的基因寡核苷酸片段,CCGAAG,5,3,帶有突變核苷酸的寡核苷酸片段與M13（+）鏈復(fù)性。,錯(cuò)配的核苷酸位于片段的中部，以利于復(fù)性雜交。,GGCTTA,CCGAA,5,3,G,以寡核苷酸鏈作引物，以M13（+）作模板,用Klenow片段合成M13（-）鏈。,GGCTTA,G,CCGAA,5,3,用T4DNA連接酶連接結(jié)成完整的雙鏈,GGCTTA,CCGAAG,轉(zhuǎn)化大腸桿菌，噬菌體DNA在大腸桿菌中擴(kuò)增，形成一半野生型M13雙鏈DNA，一半突變型M13雙鏈DNA噬菌體。,野生型,CCGAAG,誘變型,GGCTTC,GGCTTA,CCGAAT,（M13的復(fù)制型是雙鏈環(huán)狀DNA）。,母鏈,（3）缺點(diǎn)：,分離提取M13雙鏈DNA，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用寡聚核苷酸探針挑選突變型載體克隆。,切下突變基因，接到表達(dá)載體中表達(dá)誘變的蛋白質(zhì)。,通常只有1%-5%的噬菌斑含有突變的基因。,（4）改進(jìn)：,目的基因插入雙鏈形式的M13噬菌體后，轉(zhuǎn)入特殊的受體菌株中。,2.寡核苷酸介導(dǎo)的PCR誘變,（1）方法,將目的基因克隆到質(zhì)粒上。,在欲突變的位置上設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別帶有兩條鏈的突變核苷酸。,ATGCATGCATGCATGC,TACGTACGTACGTACG,ATGAATGCATGC,TACG,ATGCATGCATGCATGC,TACGTACGTACGTACG,CATGC,TACGTACTTAC,P1,P2,P3,P4,分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出線性的全長(zhǎng)質(zhì)粒。,但兩組PCR產(chǎn)物的末端位置不同。,TACTTACGTACG,ATGC,ATGAATGCATGC,TACG,GTACG,ATGCATGAATG,TACGTACTTAC,CATGC,PCR產(chǎn)物變性成單鏈，混合后復(fù)性，形成具有粘性末端的雜交雙鏈（1-4；2-3）。,1,2,3,4,TACTTACGTACG,TACG,GTACG,TACGTACTTAC,ATGC,ATGAATGCATGC,ATGCATGAATG,CATGC,環(huán)化成有兩個(gè)切口的開環(huán)質(zhì)粒。用連接酶連接或直接轉(zhuǎn)入細(xì)菌（細(xì)菌會(huì)修復(fù)切口）。,1,4,2,3,粘性末端,粘性末端,3.改進(jìn)型雙引物誘變,方法（是目前較常用的方法之一）：,目的基因克隆到M13噬菌體載體中。,分離提取M13單鏈DNA作模板。,設(shè)計(jì)兩個(gè)不同區(qū)段的PCR引物，延伸方向一致，其中一個(gè)引物的5端磷酸化。,引物1上引入突變核苷酸。引物2對(duì)應(yīng)于載體上的一個(gè)單一酶切位點(diǎn)，并將這個(gè)位點(diǎn)突變一個(gè)核苷酸，使內(nèi)切酶無法識(shí)別。（一般設(shè)計(jì)在抗菌素抗性基因內(nèi)）。,ATGCATGCATGCATGC,TACTTACGTACG,欲突變的位點(diǎn),引物1,CTGGAATTCATGCGAC,GACCTTAAATACG,引物2,單一酶切位點(diǎn),P,磷酸化,用DNA聚合酶延伸后用T4DNA連接酶連接成雜交雙鏈。,ATGCATGCATGCATGC,TACTTACGTACG,CTGGAATTCATGCGAC,用引物2對(duì)應(yīng)的單一限制性內(nèi)切酶切雜交雙鏈，會(huì)得到模板鏈被切開一個(gè)口但新生的鏈完整的雜交雙鏈環(huán)。,EcoRI酶切口,轉(zhuǎn)化修復(fù)缺陷型大腸桿菌。,GACCTTAAATACG,4.重疊延伸誘變,模板鏈由于已經(jīng)成為線性分子，且又不能被修復(fù)，所以不能在菌體內(nèi)穩(wěn)定存在，只剩下新生的突變鏈在菌體內(nèi)復(fù)制。,目的基因克隆到載體上（不一定是M13）。,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：,引物1和引物2是目的基因兩端的載體上的通用引物；引物3和引物4是與突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的反向互補(bǔ)序列。,1,2,CTGCTACGG,GACGATGCC,CTGCTGCGG,GACGACGCC,引物3,引物4,分別以引物1、4和引物2、3為組合進(jìn)行PCR。結(jié)果形成帶有突變的基因的左右兩個(gè)部分。,GACGACGCC,CTGCTGCGG,1,4,CTGCTGCGG,3,GACGACGCC,2,兩組PCR產(chǎn)物混合后變性、復(fù)性，可能形成下列兩種雜交鏈，其中一種復(fù)性方式能夠進(jìn)一步在3端繼續(xù)延伸，補(bǔ)足全長(zhǎng)基因序列。,1G,4C,2C,3G,不能延伸,能延伸,1G,2C,帶突變的全長(zhǎng)基因,除去多余的引物，用通用引物1、2依次為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到含有預(yù)期突變位點(diǎn)的基因。,1G,2C,1,2,插入載體進(jìn)行表達(dá)突變的產(chǎn)物。,第二節(jié)基因工程生產(chǎn)抗體,每一種生物的生命都始終經(jīng)受著其他物種的威脅。自然法則之一,一、抗體（antibody）,1.脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)有三種基本的工作形式：,（1）細(xì)胞免疫（cellularimmunity）,T細(xì)胞中的一類（KillerTcell）殺死被病原感染的細(xì)胞。,T細(xì)胞中的另一類（HelperTcell）對(duì)病原做出反應(yīng)，分泌蛋白質(zhì)（淋巴因子）刺激機(jī)體作出整體反應(yīng)（如產(chǎn)生巨噬細(xì)胞等）。,（2）淋巴免疫,（3）體液免疫,B細(xì)胞分泌抗體與病原結(jié)合。,二、抗體的結(jié)構(gòu)和功能,（1）抗體的結(jié)構(gòu),有兩條相同的重鏈（H）和兩條相同的輕鏈（L）組成的Y字形四聚體。,（2）抗體各部位的功能,抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn),位于H鏈和L鏈的N端（Y字形的支角上）。,恒定區(qū)（C區(qū)）,有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）組成，這三個(gè)CDR都位于H鏈和L鏈的N端的可變區(qū)內(nèi)（VH、VL）,重鏈上有3個(gè)（CH1、CH2、CH3），輕鏈上有1個(gè)（CL）。,不同的抗體分子的恒定區(qū)的差異只有一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。,抗體分子的空間結(jié)構(gòu),（3）木瓜蛋白酶處理后的抗體的結(jié)構(gòu),木瓜蛋白酶可將抗體分解成3各部分：,兩個(gè)Fab片段：,屬于Y字形的兩個(gè)角。包含完整的L鏈和H鏈的VH和CH1,一個(gè)Fc片段,是Y字形的柄部。包括兩條重鏈的CH2和CH3,（4）Fab和Fc片段的功能,Fab具有抗原結(jié)合活性和特異性。,其實(shí)只要Fab上的VH和VL（合稱Fv片斷）即可。,Fc片段沒有抗原結(jié)合活性，但它是抗原結(jié)合到抗體上后激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的主要部位。,三、抗體的表達(dá)系統(tǒng),1.在重組噬菌體中篩選生產(chǎn)抗體,（1）原理：,抗體分子的Fab（Fv片段）是抗原的結(jié)合區(qū)。,Fv片段編碼重鏈和輕鏈的基因形成任意組合，然后檢測(cè)他們與所需抗原的結(jié)合能力。,（2）克隆載體,分別克隆H鏈和L鏈的Fv片段，形成兩種鏈的cDNA文庫。載體或M13載體。,絲狀噬菌體（單鏈環(huán)狀DNA）。如M13、fd、f1等。,（3）表達(dá)載體,Filamentousphagefd,g3p：外殼蛋白3；其余類似。,（3）方法,噬菌體展示（Phagedisplay）：,將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。,細(xì)菌表面展示（Bacteriasurfacedisplay）,從經(jīng)過免疫的小鼠或人的B細(xì)胞中分離mRNA（既有重鏈也有輕鏈的mRNA）。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。設(shè)計(jì)一對(duì)重鏈的引物和一對(duì)輕鏈的引物，通過PCR將重鏈和輕鏈的cDNA擴(kuò)增。用特定的限制性內(nèi)切酶切PCR產(chǎn)物。,輔助M13噬菌體：噬菌體外殼蛋白基因完整。,從H鏈文庫和L鏈文庫中隨機(jī)切出H鏈和L鏈片段，把酶切后的H鏈和L鏈片斷連接，隨機(jī)克隆到M13載體的外殼蛋白3（或8）下游，形成融合蛋白文庫。（抗體組合文庫）,把重鏈和輕鏈的cDNAPCR片段分別克隆到克隆載體中，制成cDNA文庫。,構(gòu)建M13載體：只包含外殼蛋白3（或8基因）、細(xì)菌和病毒復(fù)制起點(diǎn)。,提取各噬菌斑的重組噬菌體顆粒，與抗原進(jìn)行親和分析，尋找結(jié)合力最強(qiáng)的噬菌體。,分析親和力強(qiáng)的載體上的抗體基因組合序列，轉(zhuǎn)到其他的表達(dá)載體上表達(dá)。,重組載體與輔助載體共同感染細(xì)菌，形成有重組的M13外殼（3蛋白或8蛋白上連著抗體片段）的M13（內(nèi)部所包裝的DNA絕大多數(shù)是載體，輔助載體DNA復(fù)制效率差）。,第三節(jié)基因工程生產(chǎn)疫苗,一、傳統(tǒng)疫苗,1.民間：,利用天花的干痂來預(yù)防天花。,1796年鄉(xiāng)村醫(yī)生EdwardJenner用一種溫和的奶牛的疾病牛痘感染人類，發(fā)現(xiàn)牛痘感染過的人不會(huì)再被天花感染。,2.第一次獲得了真正意義上的疫苗,Jenner把從牛逗膿瘡中得到的滲出液注射到8歲的小男孩JamesPhipps的體內(nèi)，經(jīng)過3次注射后，Phipps對(duì)天花有了完全的抗性。,19世紀(jì)末，LouisPasteur制成狂犬病疫苗。VonBehring制成白喉病疫苗。KitasatoShibasaburo制成破傷風(fēng)病疫苗,現(xiàn)在人類已經(jīng)獲得了麻疹、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、天花、脊髓灰質(zhì)炎等病的疫苗。,3.疫苗的發(fā)展,但對(duì)艾滋病、瘧疾、肺結(jié)核等依然束手無策?？赡苁切枰?xì)胞免疫（只有減毒活疫苗才能有效地誘發(fā)細(xì)胞免疫）。,典型的疫苗主要是滅活的和減毒的致病物質(zhì)。病源物在培養(yǎng)、純化后，或者被滅活，或者被降低毒性，但前提是不能喪失其引起免疫反應(yīng)的能力。,4.疫苗的成分,5.傳統(tǒng)疫苗的局限性,（1）有些致病物無法在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所以很多病沒辦法獲得疫苗。,（2）動(dòng)物和人的病毒需要在動(dòng)物細(xì)胞中培養(yǎng)，成本極高。,（3）培養(yǎng)的動(dòng)物或人類病毒的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量一般較低。（4）需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員采取保護(hù)措施。（5）疫苗中的致病物質(zhì)在生產(chǎn)中有可能沒有被完全殺死或充分減毒。（6）減毒的菌株有可能發(fā)生突變。（7）有些疾?。ㄈ鏏IDS）用傳統(tǒng)的疫苗防治效果甚微。（8）絕大多數(shù)現(xiàn)行的疫苗的有效期都很短，并需要冷凍保存，不利于在落后地區(qū)推廣。,二、基因工程疫苗,用基因工程的方法表達(dá)出病源物的一段基因序列，將表達(dá)產(chǎn)物（多數(shù)是無毒性、無感染能力、但有較強(qiáng)的免疫原性）用作疫苗。目前使用的多數(shù)乙肝疫苗就屬于基因工程疫苗。,1.亞基疫苗（subunitevaccine）,利用病源物的某一部分制得的疫苗稱為亞基疫苗。,亞基疫苗非常適合于用基因工程技術(shù)生產(chǎn)。避免了直接使用病源物帶來的危險(xiǎn)。利用純化的蛋白質(zhì)作免疫源，避免了由于外源蛋白和核酸的混雜造成的副作用。,缺點(diǎn),純化蛋白十分昂貴。純化后的蛋白的構(gòu)象可能與在體內(nèi)時(shí)不同，導(dǎo)致抗原性發(fā)生變化。亞基疫苗不具備感染性，所以一般不能激活MHCI分子，也就很難激活殺傷性T細(xì)胞。,（1）亞基疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn),（2）亞基疫苗舉例,單純皰疹病毒（HSV）疫苗,衣殼呈20面體，周圍有一層無定形的物質(zhì)（殼皮）覆蓋。殼皮外是類脂雙層膜。,基因組是線性雙鏈DNA，長(zhǎng)152.5kb，含有末端重復(fù)序列和內(nèi)部重復(fù)序列。,TRL,長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)UL,IRL,IRS,短獨(dú)特區(qū)US,TRS,長(zhǎng)基因組區(qū),短基因組區(qū),HSV的核心是纏有DNA的纖絲卷軸，纖維的末端在衣殼下側(cè)固定。,HSV顆粒中至少有33種蛋白，其中一半是糖蛋白。制備亞基疫苗的基本前提是鑒定出哪些成分能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體。HSV-1型的衣殼蛋白D（gpD）就是能引起老鼠產(chǎn)生完整的HSV抗體的成分。,gpD是個(gè)膜蛋白，把其跨膜區(qū)刪除，成為分泌蛋白，成為疫苗。,膜,N端（膜外）,C端（膜內(nèi)）,跨膜區(qū),膜,C,N,改造過的gpD,口蹄疫病毒（FMDV）疫苗,傳統(tǒng)的口蹄疫疫苗是用甲醛滅活的口蹄疫病毒。,FMDV中得到抗體產(chǎn)生的主要成分是病毒衣殼蛋白1（VP1）。,（foot-and-mouthdiseasevirus）FMDV是單鏈RNA病毒。對(duì)牛和豬有極強(qiáng)的毒性。,將VP1的cDNA克隆表達(dá)、純化。,2.肽疫苗,衣殼蛋白組成的外殼,病毒衣殼,病毒核酸,動(dòng)物病毒結(jié)構(gòu),根據(jù)動(dòng)物病毒的結(jié)構(gòu)，可以推測(cè)：,只有位于衣殼外表的蛋白結(jié)構(gòu)域才能引起免疫反應(yīng)。因此只需要合成衣殼蛋白的抗原決定簇（小肽）就可以當(dāng)作疫苗。,VP1C端的3個(gè)肽段（141-160aa、151-160aa、200-213aa）和N端的3個(gè)肽段（9-24aa、17-32aa、25-41aa）分別接到載體蛋白上（提高小肽的穩(wěn)定性）。,結(jié)果：141-160aa的肽段能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生足夠的FMDV抗體。如果把141-158aa與200-213aa兩個(gè)肽段連起來，不用載體蛋白穩(wěn)定就能激發(fā)豚鼠產(chǎn)生高水平的抗體。比任何一個(gè)肽段單獨(dú)使用更有效。,把VP1的142-160aa序列于具有強(qiáng)免疫源性的載體蛋白乙肝抗原蛋白（HBcAg）連接，會(huì)自動(dòng)組裝成“27nm”顆粒，VP1的小肽恰好位于顆粒外表面。這可能成為未來投送肽疫苗的常規(guī)方法。,肽疫苗的局限性：,肽段不能太長(zhǎng)、肽段的構(gòu)象與抗原決定簇的構(gòu)象要一致、必須有足夠強(qiáng)的免疫源性。,3.活體重組疫苗,用基因工程的方法對(duì)細(xì)菌和病毒進(jìn)行改造，使之成為活體重組疫苗（liverecombinantvaccine）,組成：,可以是非致病的微生物，用基因工程方法使之帶上并表達(dá)某種特定病源物的抗原決定簇基因，產(chǎn)生免疫原性。,也可以是本來的致病微生物，通過基因改造去掉毒性基因后仍保持免疫原性。,霍亂活體重組疫苗的制作,病原菌：霍亂弧菌（Vibrocholerae）,致病物：腸毒素。,腸毒素的結(jié)構(gòu)：,1個(gè)A亞基和5個(gè)相同的B亞基。A亞基有ADP糖基化活性，有兩個(gè)功能域：A1肽（毒性區(qū)，194aa）、A2肽（連接A1和B亞基）。,亞基疫苗對(duì)霍亂菌的感染沒有免疫作用。,利用重組DNA技術(shù)破壞A1肽的基因序列，使突變的菌株不能產(chǎn)生腸毒素，成為非致病菌，做疫苗。,4.細(xì)菌疫苗,在非致病菌的細(xì)胞表面插入致病菌的表面抗原。,在細(xì)菌的鞭毛蛋白的高變區(qū)基因中插入霍亂菌素B亞基的50個(gè)氨基酸的DNA片斷。然后把重組DNA導(dǎo)入無鞭毛的沙門氏菌株。,實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入后的表達(dá)產(chǎn)物既有正常的鞭毛功能，又能激發(fā)小鼠產(chǎn)生高水平的針對(duì)霍亂菌素的抗體。,5.腫瘤疫苗,腫瘤疫苗的應(yīng)用基礎(chǔ)是存在腫瘤特異性抗原，同時(shí)免疫系統(tǒng)對(duì)該抗原能夠產(chǎn)生有效的應(yīng)答。,(1)腫瘤細(xì)胞疫苗,用腫瘤細(xì)胞作為抗原而制備的疫苗（必須事先滅活）。,（2）基因工程腫瘤疫苗,將不同的外源基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后再制成疫苗。,機(jī)理不十分清楚、效果很差。仍需努力。,6.DNA疫苗,1993年Wolff等意外地發(fā)現(xiàn)將DNA直接注射到小鼠骨骼肌細(xì)胞后可直接引起特異性免疫反應(yīng)，而且可以持續(xù)2個(gè)月以上。,1994年和1995年WHO和美國科學(xué)院分別召開專題會(huì)議討論DNA免疫的應(yīng)用前景。,流感病毒的核心蛋白抗原（NP）,表達(dá)載體,小鼠骨骼細(xì)胞,流感病毒,小鼠存活率提高50%！,（1）DNA疫苗的構(gòu)成,DNA疫苗是指含有一種病原體抗原編碼基因的重組質(zhì)粒DNA。,抗原編碼基因,對(duì)于不易變異的病原：,選用病原體表面糖蛋白編碼基因。,對(duì)于容易變異的病毒：,選擇各型共有的核心蛋白基因中的保守DNA序列。,i）選用,ii）抗原編碼基因的分離和篩選,表達(dá)文庫免疫技術(shù)（ELI）,Expression-libraryimmunization),基本原理：,病原體的DNA片段,特定的質(zhì)粒,病原基因文庫,分別進(jìn)行DNA免疫測(cè)試,篩選病原基因組中最具有免疫激活反應(yīng)的DNA片段,質(zhì)粒表達(dá)載體,大多數(shù)采用pUC系列的質(zhì)?；竟羌堋?基本組成元件：,細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)（ColEIori）。細(xì)菌抗性基因（Ampr、Kanr）。PolyA加尾信號(hào)。CpG序列（增強(qiáng)DNA免疫活性）。哺乳動(dòng)物強(qiáng)啟動(dòng)子（CMV、SV40）。,CMV：cytomegalovirus（巨細(xì)胞病毒）。,（2）DNA疫苗的作用機(jī)理,與重組亞基疫苗類似，都是利用單一的蛋白質(zhì)抗原分子來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。,（3）DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn),既能誘導(dǎo)體液免疫，又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。同一個(gè)質(zhì)粒上可以容納多個(gè)抗原基因，有可能獲得對(duì)多種疾病的免疫能力。DNA比蛋白質(zhì)容易制備和保存。,（4）DNA疫苗的缺點(diǎn),普遍存在免疫效力低的問題。安全性問題（整合位點(diǎn)、后果）,（5）DNA疫苗的改進(jìn),載體的優(yōu)化,增強(qiáng)載體的表達(dá)能力：如采用增強(qiáng)子啟動(dòng)子復(fù)合物。,提高載體的復(fù)制能力：（DNA疫苗不能自我復(fù)制）,甲病毒（alphavirus）是個(gè)負(fù)鏈RNA病毒，編碼復(fù)制酶（具有自我水解功能）?？梢栽诩闹骷?xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制。有可能利用該病毒作載體（用外源基因替換其結(jié)構(gòu)基因）。,用CpG序列優(yōu)化載體：,試驗(yàn)表明適當(dāng)長(zhǎng)度的非甲基化的CpG序列對(duì)提高DNA疫苗的免疫原性具有重要的作用。,第四節(jié)人類疾病的基因治療,迄今為止，還沒有遺傳病患者經(jīng)傳統(tǒng)的治療方法治療后能過上正常人的生活，他們的后代也同樣難逃厄運(yùn)。,臨床統(tǒng)計(jì)：,25%的生理缺陷、30%的兒童死亡、60%的成年人疾病都是由遺傳疾病引起的。,一、基因治療的回顧和現(xiàn)狀,（1）基因治療的概念,向靶組織或細(xì)胞中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療的目的。,（2）基因治療的發(fā)展,1973年一名美國醫(yī)生在德國給一對(duì)姐妹（缺少一種稀有的酶）注入肖普氏乳頭瘤病毒，結(jié)果無效。,第二例是在1980年，美國一名醫(yī)生對(duì)兩名地中海貧血患者進(jìn)行基因治療。由于未得到NIH的批準(zhǔn)，受到廣泛的抨擊。,后來開始在動(dòng)物身上進(jìn)行試驗(yàn)。,NIH及其下屬的重組DNA顧問委員會(huì)經(jīng)過長(zhǎng)期的審查，終于批準(zhǔn)了美國第一例臨床治療申請(qǐng)。1990年9月14日正式開始，由Genetictherapy公司和NIH?；颊撸簝晌换紘?yán)重綜合性免疫缺損癥（SCID）（缺少腺苷酸脫氨酶（ADA）的姑娘。,第一位接受基因治療的人,AshantiDiSilva,方案：把克隆的腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入患者的T淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)。療效：AshantiDiSilva的癥狀有所改善，25-30%的T細(xì)胞能維持正常的ADA水平，至今生活正常。,但與她同時(shí)接受治療的另一位女孩失敗了。,1991年Rosenberg等對(duì)50名黑色素瘤晚期患者進(jìn)行基因治療，取得一定的效果。,迄今為止，所有的基因治療方法都是針對(duì)體細(xì)胞的，處于倫理、安全、技術(shù)上的考慮，性細(xì)胞基因治療方案尚未被列入研究日程。,方案：把外源的腫瘤壞死因子基因轉(zhuǎn)入腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL），結(jié)果這種TIL能集中在腫瘤所在的部位殺死腫瘤細(xì)胞。,二、體細(xì)胞治療的生物學(xué)問題,（1）如何選定并獲得用來進(jìn)行基因治療的細(xì)胞。（2）如何將修正的目的細(xì)胞重新引入患者體內(nèi)。（3）如何控制轉(zhuǎn)入的正?；虻谋磉_(dá)。（4）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能否在體內(nèi)增值。,三、基因治療的方案,1.體外原位（exvivo)基因治療,把病人的體細(xì)胞取出，在體外加入正常基因校正，再把校正的細(xì)胞放回病人體內(nèi)。已批準(zhǔn)了100多個(gè)臨床方案。,2.體內(nèi)（invivo）基因治療,原位：將新基因直接引入病人的疾病部位（病毒載體或DNA)。,通過血液把治療性基因帶到病組織。,引入目的基因的mRNA的反義序列，與目的基因的mRNA相配對(duì)，造成供翻譯的mRNA大量減少，制止病基因的表達(dá)。也可以引入目的基因的反義DNA。,3.反義（antisense）基因治療。,反義RNA的作用,反義寡聚RNA與mRNA形成雙鏈后，誘使RNaseH把mRNA切斷,核酶是一類具有催化活性的RNA分子。參與細(xì)胞內(nèi)多種RNA及其前體的加工和成熟過程。,4.核酶（ribozyme）基因治療。,發(fā)現(xiàn)者Altman和Cech獲1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,1988年，Haseloff和Cerlsch根據(jù)核酶RNA的錘頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出第一個(gè)具有特異切割活性的人造核酶，并在體證實(shí)它確實(shí)具有特異性的切割活性。,其中利用核酶抗HIV感染的工作尤其受到重視。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，核酶確實(shí)具有切割HIV基因組并阻斷其復(fù)制的效果。,四、基因治療用的載體,1.反轉(zhuǎn)錄病毒載體,主要是病毒。,反轉(zhuǎn)錄病毒（ritrovirus）屬于正鏈RNA病毒，顯著的特點(diǎn)是具有2倍體基因組。兩個(gè)相同的RNA分子在5端附近經(jīng)氫鍵連接形成70SRNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)節(jié)作用。,基因組結(jié)構(gòu)：類似于真核細(xì)胞mRNA,反轉(zhuǎn)錄病毒一般只感染處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞。,反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu),流感病毒,HIV,如Moloneymurineleukemiavirus(MoloneyMLV),env,pol,gag,U3,U3,U5,U5,cap,polyA,3,5,LTR,LTR,U5、U3：5段或3端獨(dú)特序列。,LTR：長(zhǎng)末端重復(fù)序列。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。整合時(shí)，整合酶在U5-U3連接處切開雙鏈DNA，隨機(jī)插入到宿主基因組里。LTR本身還具有啟動(dòng)子和polyA加尾信號(hào)的功能。,R,R,+,+：組裝時(shí)必需的非編碼序列。env：外殼蛋白。pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。gag：核心蛋白。,（1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點(diǎn),能穩(wěn)定地將DNA插入宿主基因組的隨機(jī)位點(diǎn)上。侵染范圍廣、感染率高。整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定，拷貝數(shù)目較低。包裝的外源DNA可達(dá)10kb。反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，對(duì)宿主細(xì)胞沒有毒性。,（2）用于基因治療的反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建,把反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中的整個(gè)pol、env和gag基因的3端刪除。插入標(biāo)記基因（如neor）。外源基因和啟動(dòng)子插入到+下游。,5LTR,+,外源基因,neor,3LTR,反轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的效率很低，必須包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。,用兩個(gè)缺失了+的反轉(zhuǎn)錄病毒染色體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以制造病毒外殼蛋白。,（3）包裝細(xì)胞系的構(gòu)建,5LTR,gag,3LTR,pol,env,3LTR,5LTR,病毒外殼蛋白,包裝細(xì)胞,（4）載體RNA的包裝,用載體DNA轉(zhuǎn)化包裝細(xì)胞系,轉(zhuǎn)入的載體上帶有+，轉(zhuǎn)錄成的載體RNA就會(huì)被包裝細(xì)胞中原有的病毒外殼蛋白識(shí)別包裝成重組病毒顆粒。,5LTR,+,外源基因,neor,3LTR,（5）利用這種重組病毒顆粒，高效轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞進(jìn)行基因治療。,2.腺病毒（adenovirus）載體,（1）腺病毒的基因組：,（2）腺病毒的優(yōu)點(diǎn)：,比較安全，無致病、致癌、致畸作用。宿主范圍廣，不僅能感染有分裂能力的細(xì)胞，也能感染不能分裂的細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）。,線狀雙鏈DNA病毒，基因組中有14個(gè)基因。共同特點(diǎn)是都帶有倒置的末端重復(fù)（ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。,腺病毒的結(jié)構(gòu),可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式進(jìn)行基因治療。載體中的插入片段可達(dá)7.5kb（有包裝容量限制）。腺病毒容易制備、純化。基因組結(jié)構(gòu)和功能了解得清楚。,是目前最常用的基因治療載體之一。,把腺病毒DNA刪除一些非必須區(qū)（如E1或E3區(qū)），增加插入能力。,構(gòu)建質(zhì)粒，含有E1或E3區(qū)兩側(cè)的同源序列。兩側(cè)序列之間插入外源基因和選擇標(biāo)記基因。,（3）腺病毒載體的構(gòu)建,用同源重組的方法插入外源基因。,ITR,E1,ITR,E3,把質(zhì)粒切成線性。,質(zhì)粒與病毒DNA（缺失E1或E3）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中發(fā)生同源重組，把外源DNA加到病毒基因組中。,分離重組腺病毒，成為基因治療的載體。,（4）重組腺病毒DNA在細(xì)胞中的生存,以游離的附加體形式存在于細(xì)胞中，不能整合到細(xì)胞基因組中?；虮磉_(dá)時(shí)間短。E1是腺病毒繁殖的必須區(qū)。缺失E1的重組腺病毒必須在已經(jīng)被腺病毒（輔助病毒）感染的細(xì)胞中繁殖。E3區(qū)在腺病毒的繁殖過程中不是必需的。缺失E3的重組腺病毒不需要輔助病毒。,五、癌癥的基因治療,國際上已批準(zhǔn)的130多種基因治療方案中，70%是針對(duì)癌癥的。,（1）癌癥的基因治療中常用的治療性基因,直接殺傷或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的基因：,抑癌基因、癌基因的反義序列、編碼細(xì)胞程序性死亡的基因等。,可提高免疫系統(tǒng)能力的基因：,細(xì)胞因子基因等。,（2）導(dǎo)入抑癌基因的基因治療,多種藥物的耐藥性基因：,主要目的是提高造血細(xì)胞及其他細(xì)胞對(duì)放療、化療及其他抗癌藥物的耐受性。,癌癥一般是一對(duì)抑癌基因都發(fā)生了失活突變。因此導(dǎo)入一個(gè)抑癌基因能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至使腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。,如抑癌基因：Rb、P16、P21、P53、Dcc等。,（3）針對(duì)癌基因的基因治療,用反義療法導(dǎo)入癌基因的反義DNA或RNA，使癌基因產(chǎn)物減少。,如k-ras的反義基因。,（4）用“自殺基因”（suicidegene）,將一種基因轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，這種