分子生物學(xué) 第三章 DNA的復(fù)制和修復(fù)ppt精選課件

.,第三章DNA的復(fù)制,DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長(zhǎng)鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。,.,DNA通過(guò)復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。,.,在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過(guò)復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富了中心法則的內(nèi)容。,.,DNAdependentDNApolymeraseDDDPDNAdependentRNApolymeraseDDRPRNAdependentRNApolymeraseRDRPRNAdependentDNApolymeraseRDDP,.,.,第一節(jié)DNA復(fù)制概況,一.DNA復(fù)制的半保留性DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。,.,DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：,.,二.復(fù)制子（replicon),復(fù)制子:基因組中能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制的單位。每個(gè)起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)復(fù)制子。,.,1.起始點(diǎn)（originofreplication,ori),原核生物DNA分子中只有一個(gè)起始點(diǎn)，長(zhǎng)度200bp左右。大腸桿菌oriC有245bp。真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。,.,.,E.coli中的Ori區(qū)富含AT和回文對(duì)稱的序列。這種特殊的結(jié)構(gòu)與復(fù)制起點(diǎn)易于解鏈以發(fā)動(dòng)DNA復(fù)制（形成“呼吸現(xiàn)象”）和促進(jìn)聚合酶與DNA結(jié)合的功能高度統(tǒng)一。,.,isolationofori,.,.,大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列,.,2.終點(diǎn)（ter）,對(duì)E.coliDNA復(fù)制過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，其兩個(gè)復(fù)制叉總是在一個(gè)固定的位點(diǎn)相遇，這個(gè)特殊的位點(diǎn)包含兩個(gè)分別由3個(gè)終止子（terminus）組成的終止區(qū)域terE，terD，terA和terF，terC，terB，其中每個(gè)終止子含有相對(duì)保守的22bp序列（有說(shuō)23bp共有序列？），分別負(fù)責(zé)對(duì)不同區(qū)域的復(fù)制叉行使終止功能。,.,目前已經(jīng)分離出相對(duì)分子質(zhì)量為3.6103的終止蛋白Tus（terminusutilizationsubstance）。這種終止蛋白能識(shí)別ter序列，形成terTus復(fù)合體，以防止DNA過(guò)度復(fù)制，避免出現(xiàn)DNA多聚體。,.,為了保證DNA復(fù)制的完整性，每一個(gè)復(fù)制叉必須穿過(guò)另一復(fù)制叉的終止區(qū)才能到達(dá)自身終止區(qū)，并可以在其中3個(gè)位點(diǎn)的任一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生終止。如果兩個(gè)復(fù)制叉的延伸速度不一致，或因某種原因一個(gè)復(fù)制叉的延伸過(guò)程被拖延，先期到達(dá)終止子的復(fù)制叉會(huì)停留等待另一復(fù)制叉的經(jīng)過(guò)，共同完成全基因組的復(fù)制過(guò)程。,.,三.復(fù)制的方向性,復(fù)制的方向：?jiǎn)蜗蚧螂p向,.,.,.,雙向復(fù)制DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。,.,.,.,.,四.引物RNADNA復(fù)制的起始必須先期合成一段引物分子。研究表明無(wú)論是原核生物還是真核生物，大多數(shù)引物復(fù)制是一段長(zhǎng)度不等的，一般為10個(gè)核苷酸左右的RNA分子。（有說(shuō)為110個(gè)核苷酸？）,.,所有DNA聚合酶具有一個(gè)共同的特點(diǎn)均不能自主地發(fā)動(dòng)DNA的復(fù)制，只能利用已提供的核苷酸3OH末端聚合dNMP，合成DNA鏈。它們必須以一段具有3端自由羥基（3-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。引物RNA的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對(duì)。,.,五.DNA的半不連續(xù)復(fù)制由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為35。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。,.,以35方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?3，這一條鏈被稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。而以53方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是53，這條鏈被稱為滯后鏈(laggingstrand)。,.,由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為10002000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。,.,第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶、相關(guān)蛋白及酶學(xué)機(jī)制,在細(xì)胞中，雙螺旋DNA復(fù)制是DNA聚合酶催化的酶促反應(yīng)過(guò)程。但DNA聚合酶只能延長(zhǎng)已有的DNA或RNA引物鏈，不能從頭起始DNA鏈的合成,.,另外，在DNA復(fù)制中形成特殊的復(fù)制叉（或生長(zhǎng)叉）結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，DNA雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋DNA解旋（unwinding），并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成DNA聚合酶不能完成這一過(guò)程,.,在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段（Okazakifragment）的連接也是DNA聚合酶無(wú)法完成的。實(shí)際上，在復(fù)制叉處進(jìn)行復(fù)雜的DNA復(fù)制過(guò)程中，需要許多相關(guān)的酶和蛋白因子參與。,.,除DNA聚合酶外，還包括：DNA旋轉(zhuǎn)酶；使DNA雙股鏈在復(fù)制叉解開的解旋酶；在DNA復(fù)制前防止解開的DNA單鏈局部退火的DNA結(jié)合蛋白；合成RNA引物的酶；除去RNA引物的酶；使岡崎片段共價(jià)連接的DNA連接酶等重要的酶與蛋白因子。,.,DNA聚合酶、引物的引發(fā)酶、DNA解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、連接酶等在內(nèi)的如此眾多的酶分子均集中在復(fù)制交叉處組成一個(gè)復(fù)合體協(xié)同互作，共同完成DNA分子的復(fù)制過(guò)程，這種復(fù)合體也稱為DNA復(fù)制體（replisome）。,.,一.DNA聚合酶,（一）原核生物DNA聚合酶種類在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)有五種:DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）,.,前三種酶（DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。DNA聚合酶催化DNA新鏈中脫氧核苷酸之間的聚合反應(yīng)的酶。參與DNA復(fù)制的主要是pol和pol。,.,.DNA聚合酶I,1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNA聚合酶I。大腸桿菌K-12株的DNA聚合酶I由基因polA編碼，由928個(gè)氨基酸組成，分子量103.1kDa，結(jié)構(gòu)類似球狀，直徑約650nm，每個(gè)細(xì)胞約有400個(gè)分子。,.,此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。,.,1）聚合作用：53；2）35外切酶活性：校對(duì)（或正）功能；3）53外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)，主要功能是切除引物、填補(bǔ)岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)；,.,.,.,如果新鏈合成過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)配，新添加的核苷酸因?yàn)榕c模板不能正確配對(duì)，將形成單鏈尾巴，此單鏈末端可被DNA聚合酶識(shí)別，并以3-5外切酶活性切除此核苷酸，再用其聚合酶活性配對(duì)正確的核苷酸，此功能被稱為校讀功能。,.,DNApol是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級(jí)結(jié)構(gòu)以-螺旋為主。用特異的蛋白酶（如枯草桿菌蛋白酶）處理，可把DNApol水解為兩個(gè)片段，即在F，G螺旋之間發(fā)生斷裂。,.,小片段，具有323個(gè)氨基酸殘基，小片段的分子量為35KD，具有53外切酶活性?？梢灾饌€(gè)切除處于配對(duì)狀態(tài)的具5磷酸末端的核苷酸，一次最多可以切除10個(gè)核苷酸。,.,大片段或稱Klenow片段，具有604個(gè)氨基酸殘基，分子量為68KD，具有DNA聚合酶活性和35外切酶活性；53聚合酶活性使Klenow片段可以3OH末端添加新的核苷酸延長(zhǎng)已存在的多核苷酸鏈。,.,3-5外切酶活性則令Klenow片段可以從DNA的3端，即新鏈生長(zhǎng)端開始逐個(gè)切除核苷酸。此活性傾向于切除DNA合成中的末端錯(cuò)配堿基。,.,以上三重活性相結(jié)合，使DNA聚合酶I適用于取出起始DNA合成所需的RNA引物，并填充去除引物后DNA雙鏈中出現(xiàn)的短單鏈區(qū)域。,.,類似的短單鏈區(qū)域也可出現(xiàn)在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中切除錯(cuò)誤堿基后，故DNA聚合酶I也可用于損傷DNA的修復(fù)。但DNA聚合酶I的延伸能力不強(qiáng)，與模板接合一次只能使核苷酸鏈延長(zhǎng)20-100個(gè)核苷酸，在新鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)中不可能起主要作用。,.,pol為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中的大片段稱為Klenowfragment，具有53聚合酶活性和35外切酶的活性。,.,.,.,2.DNA聚合酶II,DNA聚合酶II具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性。,.,3.DNA聚合酶III,該酶由10個(gè)亞基組成，分別為、及。DNA聚合酶具很強(qiáng)的延伸能力，能在新鏈上每分鐘添加105個(gè)核苷酸。它是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶。,.,亞基：53聚合酶活性；亞基：35外切酶,校對(duì)和編輯；為裝配必須；以上三者構(gòu)成核心酶。,.,DNA聚合酶為不對(duì)稱異源二聚體,每個(gè)DNA聚合酶含有二個(gè)拷貝的核心酶，另外有二個(gè)拷貝的二聚化亞基連接這二個(gè)核心酶；二個(gè)拷貝的亞基負(fù)責(zé)保持核心酶與模板鏈的結(jié)合并使酶能夠沿模板鏈移動(dòng)；另外五種亞基組成復(fù)合體，可促進(jìn)全酶組裝并使亞基結(jié)合到DNA上。,.,大腸桿菌DNA聚合酶,.,pol由十種亞基組成，其中亞基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而亞基具有35外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。,.,大腸桿菌DNA聚合酶全酶的結(jié)構(gòu)和功能,延長(zhǎng)因子,DNA聚合酶異二聚體,核心酶,校對(duì),引物的結(jié)合和識(shí)別,促使核心酶二聚化,.,前導(dǎo)鏈與后隨鏈復(fù)制的方向不同,位于前導(dǎo)鏈DNA延伸點(diǎn)的復(fù)制體在完成一個(gè)岡崎片段的復(fù)制后必須解體，或以復(fù)制體整體方式才岡崎片段的末端解離后又迅速“調(diào)轉(zhuǎn)車頭”結(jié)合到新的起點(diǎn)合成岡崎片段。在大腸桿菌中完成一次基因組復(fù)制，復(fù)制體需要啟動(dòng)20004000次的岡崎片段的復(fù)制。,.,顯然這種模式是不符合生物進(jìn)化的“經(jīng)濟(jì)原則”的。隨后的研究證明每一個(gè)復(fù)制叉均含有一個(gè)DNA聚合酶的二聚體，它可以同時(shí)催化前導(dǎo)鏈和后隨鏈的同時(shí)復(fù)制?；谶@一科學(xué)發(fā)現(xiàn)，人們提出了在雙鏈DNA復(fù)制進(jìn)程中“回環(huán)模型”。,.,回環(huán)模型,即在復(fù)制叉處僅有一個(gè)大型的DNA復(fù)制體，后隨鏈的一個(gè)岡崎片段模板DNA以倒退的方式從DNA聚合酶中將模板DNA釋放出來(lái)，新岡崎片段的DNA單鏈與前導(dǎo)鏈一樣，以相同的方向完成復(fù)制。以滾環(huán)模式擴(kuò)增DNA的生物在復(fù)制叉處也是按回環(huán)模型完成DNA復(fù)制的。,.,.,聚合酶III核心酶,大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖,聚合酶I,聚合酶III核心酶,滯后鏈,前導(dǎo)鏈,解螺旋酶,引物合成酶,RNA引物,引發(fā)體,拓?fù)洚悩?gòu)酶II,-夾子,-聚體,-夾子,-復(fù)合物,RNA引物,單鏈結(jié)合蛋白（SSB）,.,復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型,.,.,主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時(shí)切除RNA引物并填補(bǔ)其留下的空隙。,修復(fù)紫外光引起的DNA損傷,DNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3-5外切酶的校對(duì)功能，提高DNA復(fù)制的保真性,原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）,.,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位點(diǎn),3,3,5,5,錯(cuò)配堿基,.,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位點(diǎn),單鏈缺口,5,.,DNA聚合酶和是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)。當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。,.,（二）真核生物中的DNA聚合酶,在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol）。,.,其中，參與染色體DNA復(fù)制的是pol（延長(zhǎng)滯后鏈）和pol（延長(zhǎng)前導(dǎo)鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是pol，pol與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，pol只在其他聚合酶無(wú)活性時(shí)才發(fā)揮作用。,.,其他學(xué)者的意見：真核生物DNA聚合酶,、及四種，都有53聚合功能。及參與核DNA復(fù)制；：鏈合成的引發(fā)，：鏈的延長(zhǎng)pol；切除引物后填補(bǔ)空隙：外切核酸酶：線粒體DNA復(fù)制,.,定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核3-5外切-+酶活性功能,引物合成,修復(fù)作用,線粒體DNA的復(fù)制,核DNA的復(fù)制,？,真核生物中的DNA聚合酶,.,至今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶都不能從頭合成多核苷酸鏈，而只能通過(guò)從3OH末端添加新的核苷酸延長(zhǎng)已存在的多核苷酸鏈。此特性決定了復(fù)制中新鏈的合成方向。,.,（三）DNA復(fù)制的保真性（即忠實(shí)性）為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：1遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2DNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對(duì)堿基的正確選擇；3對(duì)復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。合成時(shí)以RNA為引物,.,DNA聚合酶的校對(duì)功能,.,DNA聚合酶的校對(duì)功能,聚合酶,錯(cuò)配鹼基,復(fù)制方向,正確核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除錯(cuò)配核苷酸,.,DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物，而后又把這個(gè)引物消除呢？,這是保證DNA聚合過(guò)程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對(duì)復(fù)制過(guò)程中的核苷酸，也就是說(shuō)聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來(lái)開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來(lái)表示是“暫時(shí)”的，當(dāng)DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實(shí)性。,.,二.DNA旋轉(zhuǎn)酶與DNA超螺旋的松馳,天然DNA的負(fù)超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復(fù)制的進(jìn)行，復(fù)制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復(fù)制中需要DNA旋轉(zhuǎn)酶去除解螺旋酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。,.,大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）又稱拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase），由四個(gè)亞基組成四聚體22真核的呈二聚體。DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用機(jī)制如圖5-6所示。,.,圖5-6DNA旋轉(zhuǎn)酶引入超螺旋的分子模型：DNA雙鏈以右手方向繞在四聚體的酶上；：DNA雙鏈被切斷，兩個(gè)亞基以其連接處為鉸鏈轉(zhuǎn)動(dòng)，張開其靠近DNA斷裂點(diǎn)的部分；：未斷的DNA雙鏈穿過(guò)切口；：連接斷裂的DNA，以左手方向繞在酶分子上；：連接好的DNA釋放出來(lái)。,.,：DNA雙鏈以右手方向繞在四聚體的酶上；：DNA雙鏈被切斷，兩個(gè)亞基以其連接處為鉸鏈轉(zhuǎn)動(dòng)，張開其靠近DNA斷裂點(diǎn)的部分；：未斷的DNA雙鏈穿過(guò)切口；：連接斷裂的DNA，以左手方向繞在酶分子上；：連接好的DNA釋放出來(lái)。,.,DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個(gè)負(fù)超螺旋，因此可以消除復(fù)制叉向前移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，并且復(fù)制完的兩個(gè)子代DNA雙鏈的分離也需要DNA旋轉(zhuǎn)酶的催化功能。當(dāng)加入DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixicacid）等時(shí)均能抑制細(xì)菌DNA的合成?？梢奃NA旋轉(zhuǎn)酶是DNA復(fù)制所必不可少的。,.,拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)拓?fù)洚悩?gòu)酶可使DNA雙鏈中的一條鏈切斷，松開雙螺旋后再將DNA鏈連接起來(lái)，從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。拓?fù)洚悩?gòu)酶可切斷DNA雙鏈，使DNA的超螺旋松解后，再將其連接起來(lái)。,大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu),.,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopisomerase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶,.,DNA旋轉(zhuǎn)酶對(duì)真核細(xì)胞有絲分裂也是非常重要，如果不解開纏繞，在任何細(xì)胞周期中姐妹染色體都將無(wú)法分離。此外，DNA旋轉(zhuǎn)酶在轉(zhuǎn)錄、同源重組及可移動(dòng)元件的轉(zhuǎn)座中都起重要作用。,.,三.DNA解旋酶,復(fù)制過(guò)程中，復(fù)制叉在不斷前進(jìn)，復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復(fù)制能夠順利進(jìn)行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔(dān)上述任務(wù)是DNA解旋酶（DNAhelicase）和單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）。,.,DNA解旋酶是很多細(xì)胞過(guò)程所要求的（如核苷酸切除修復(fù)、同源重組、轉(zhuǎn)錄終止）。DNA解旋酶是利用ATP水解獲得的能量來(lái)打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動(dòng)的一類酶的總稱（又稱解鏈酶）。原核生物大腸桿菌為DnaB和Rep蛋白，DnaB結(jié)合于滯后鏈模板沿53方向前進(jìn)，Rep蛋白結(jié)合于前導(dǎo)鏈模板沿35方向移動(dòng)（圖5-7）。,.,8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開雙鏈DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。,rep蛋白沿35移動(dòng)，而解螺旋酶I、II、III沿53移動(dòng)。,.,DNA解鏈酶解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對(duì)堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解鏈酶。,.,真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen,T-ag）具解開雙鏈的功能。此外也在一些真核生物中分離純化出多種DNA解旋酶，其功能還在鑒定證實(shí)中。,.,圖5-7DNA雙螺旋的解旋,.,四.單鏈結(jié)合蛋白,單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB），又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。在細(xì)胞內(nèi)行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能（如同源重組）。其作用為：使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。,.,在復(fù)制中，這包括穩(wěn)定熔解起點(diǎn)，維持解旋酶活性，從DNA模板上去除二級(jí)結(jié)構(gòu)以及抑制核酸酶活性。即SSB與DNA單鏈相結(jié)合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展?fàn)顟B(tài)，以保證復(fù)制順利進(jìn)行。在E.coli中SSB為四聚體，對(duì)單鏈DNA有很高的親和性，但對(duì)雙鏈DNA和RNA沒(méi)有親合力。,.,它們與DNA結(jié)合時(shí)有協(xié)同作用，即有一個(gè)SSB與DNA結(jié)合時(shí)，就會(huì)有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴(kuò)展分布整個(gè)DNA單鏈，將DNA包被上蛋白聚合體。SSB有某些堿基組成的傾向性，但很少有順序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，可以周而復(fù)始地循環(huán)使用，在DNA的修復(fù)和重組中都有SSB的參與。,.,單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。,.,五.引發(fā)酶與引物RNA的合成,已經(jīng)證明，DNA的半不連續(xù)復(fù)制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今為止，人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA，其長(zhǎng)度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同，在大多數(shù)情況下為110個(gè)核苷酸（表5-3）。,.,表5-3DNA復(fù)制中滯后鏈前體片斷的RNA引物,.,DNA復(fù)制中以RNA作引物的實(shí)驗(yàn)證據(jù)是噬菌體M13的DNA復(fù)制對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制劑的敏感性實(shí)驗(yàn)提供的，其結(jié)果指出RNA可能提供了DNA復(fù)制的3端。此外，Reiji等設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)也證明RNA引物是DNA復(fù)制必須的,.,Reiji等設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn),即利用含甲苯的緩沖液處理大腸桿菌以提高該菌對(duì)外源核苷酸的通透性，然后再以大腸桿菌與-32P脫氧核苷三磷酸（dNTP）和未標(biāo)記的核糖核苷三磷酸（NTP）的混合物保溫，最后從大腸桿菌分離DNA和用稀堿處理。堿性水解發(fā)生在3,5-磷酸二酯鍵的磷酸基與C-5間，這樣就使dNTP的放射性磷轉(zhuǎn)移到核糖核苷酸上去（圖5-8）。,.,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每一岡崎片段都產(chǎn)生一個(gè)RNA-DNA接頭，說(shuō)明DNA的復(fù)制是以RNA為引物。,圖5-8RNA引物存在的實(shí)驗(yàn)證明,.,催化RNA引物（RNAprimer）合成的酶叫引發(fā)酶（primerase）。引發(fā)酶識(shí)別DNA單鏈模板特異順序，以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。合成岡崎片段引物分子的RNA聚合酶與負(fù)責(zé)RNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶是完全不同的兩種酶類。,.,引物與典型的RNA（如mRNA）不同，它們?cè)诤铣梢院蟛⒉慌c模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，RNA分子是RNA聚合酶作用下的產(chǎn)物，合成出的RNA分子會(huì)與模板DNA鏈分離。在E.coli中合成岡崎片段引物分子的RNA聚合酶由dnaG基因編碼，這種RNA聚合酶也稱為引發(fā)酶（primase）。,.,E.coli的引發(fā)酶是一條肽鏈，分子量為60000，每個(gè)細(xì)胞中有50100個(gè)分子。該酶單獨(dú)存在時(shí)是相當(dāng)不活潑的，只有在與有關(guān)蛋白質(zhì)相互結(jié)合成為一個(gè)復(fù)合體時(shí)才有活性。這種復(fù)合體就稱為引發(fā)體（primasome）。引物分子為DNA聚合酶合成DNA分子提供了啟動(dòng)聚合的3OH末端。,.,機(jī)體選擇RNA作為引物，其原因可能在于減少致死突變（lethalmutation）。DNA復(fù)制中，從模板拷貝最初的幾個(gè)核苷酸時(shí)，由于堿基堆集力很弱，其氫鍵結(jié)合能力也很弱，因而堿基對(duì)的錯(cuò)配幾率就大很多，加上這幾個(gè)核苷酸還沒(méi)有與模板形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶35校對(duì)功能很難發(fā)揮作用。,.,因此為了保證生物DNA復(fù)制的保真度，采用以RNA為引物這種過(guò)渡形式，既為DNA聚合酶提供3-羥基端，又容易被DNA聚合酶識(shí)別而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶進(jìn)行切口平移。切口平移過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)誤的幾率極少，因?yàn)镈NA聚合酶（polI）有35外切核酸酶活性，具有校對(duì)功能。,.,無(wú)論是前導(dǎo)鏈還是后隨鏈的引物均為RNA分子，當(dāng)DNA復(fù)制完成后，必須將RNA引物分子降解。研究證明，相對(duì)分子質(zhì)量為103103的DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后，C端形成相對(duì)分子質(zhì)量為68103的大片段，N端形成相對(duì)分子質(zhì)量為35103的小片段，大片段具有從5向3方向的聚合DNA功能和從3向5的外切校正功能，但效率較低，也稱klenow片段。小片段具有從5向3方向的外切核酸酶功能。,.,六.DNA連接酶,DNA連接酶(DNAligase)，1967年發(fā)現(xiàn)若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來(lái)在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用,.,DNA連接酶催化的條件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,.,DNA連接酶連接切口,Mg2+,連接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板鏈,模板鏈,.,第三節(jié)DNA復(fù)制過(guò)程的總結(jié)及其調(diào)控,DNA復(fù)制通常是從雙螺旋的特定位置復(fù)制原點(diǎn)（ori）開始，一般是富含A-T的區(qū)段該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強(qiáng)的呼吸作用（breathing），是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段（frequentlyopeningregion）,.,.,由此產(chǎn)生的瞬時(shí)單鏈與SSB蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，SSB）結(jié)合，對(duì)復(fù)制的起始十分重要。原核生物的復(fù)制原點(diǎn)通常為一個(gè)，而真核生物則有多個(gè)特定的復(fù)制原點(diǎn)。,.,依DNA合成的起始方式，復(fù)制可分為從新起始與共價(jià)延伸兩種類型前者是前導(dǎo)鏈從新開始，也叫復(fù)制叉式復(fù)制；后者是先導(dǎo)鏈共價(jià)結(jié)合在一條親代鏈上，也叫滾環(huán)式復(fù)制。,.,復(fù)制主要以雙向等速進(jìn)行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的復(fù)制；部分是單方向進(jìn)行，如質(zhì)粒ColE1的復(fù)制；或以不對(duì)稱的雙向方式進(jìn)行，如線粒體DNA的復(fù)制。,.,一.復(fù)制的起始,DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。1.預(yù)引發(fā)（1）解旋解鏈，形成復(fù)制叉由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。,.,單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。對(duì)于雙向復(fù)制而言，形成的兩個(gè)復(fù)制叉向相反方向行進(jìn)，每個(gè)復(fù)制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。,.,圖5-12復(fù)制叉（箭頭表示子鏈總的生長(zhǎng)方向）,.,（2）引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。2.引發(fā)在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3端自由羥基（3-OH）。,.,DNA半不連續(xù)復(fù)制的模式說(shuō)明，雙鏈DNA分子復(fù)制起始時(shí)從復(fù)制原點(diǎn)處DNA分子解鏈，前導(dǎo)鏈在一段RNA引物的發(fā)動(dòng)下連續(xù)合成的模式完成合成過(guò)程，而后隨鏈?zhǔn)前床贿B續(xù)合成的模式不斷地完成岡崎片段的合成，而每個(gè)岡崎片段都需要有RNA引物的發(fā)動(dòng)過(guò)程。,.,RNA聚合酶抑制劑利福平對(duì)DNA復(fù)制的起始也具有明顯抑制效應(yīng)。但一旦復(fù)制的起始過(guò)程完成后，利福平的抑制效應(yīng)也隨之消失，表明前導(dǎo)鏈的RNA引物是由RNA聚合酶合成的。如同基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程一樣，此RNA聚合酶可以使雙鏈DNA分子局部開鏈。,.,RNA聚合酶在合成1012個(gè)核苷酸RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前導(dǎo)鏈DNA合成；在完成10002000個(gè)核苷酸的DNA合成后，后隨鏈才在引發(fā)酶的作用下開始岡崎片段的引物RNA的合成。這一過(guò)程也稱為DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活。,.,二復(fù)制的延長(zhǎng)1.聚合子代DNA由DNA聚合酶催化，以35方向的親代DNA鏈為模板，從53方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長(zhǎng)的是DNA聚合酶；在真核生物中，是DNA聚合酶(延長(zhǎng)滯后鏈)和（延長(zhǎng)前導(dǎo)鏈）。,.,.,2.引發(fā)體移動(dòng)引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長(zhǎng)。,.,.,三復(fù)制的終止1.去除引物，填補(bǔ)缺口在原核生物中，由DNA聚合酶來(lái)水解去除RNA引物，并由該酶催化延長(zhǎng)引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來(lái)水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來(lái)延長(zhǎng)。,.,2.連接岡崎片段在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來(lái)，形成完整的DNA長(zhǎng)鏈。,.,大腸桿菌染色體復(fù)制的終止,ori,復(fù)制叉2,復(fù)制叉1,終止復(fù)制叉2,終止復(fù)制叉1,復(fù)制叉1,復(fù)制叉2,完成復(fù)制,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶,連鎖染色體,.,四染色體多復(fù)制子復(fù)制的非一致性,原核生物在染色體DNA復(fù)制完成之前，復(fù)制起始點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)新一輪的復(fù)制起始，表現(xiàn)為多個(gè)復(fù)制叉的特點(diǎn)。,.,而真核生物染色體DNA雖多為多復(fù)制子，但每一個(gè)復(fù)制子在一個(gè)細(xì)胞周期中只啟動(dòng)一次，對(duì)每一個(gè)復(fù)制子來(lái)說(shuō)，無(wú)論復(fù)制完成得早晚，都必須等待到下一個(gè)細(xì)胞周期開始后才有可能發(fā)動(dòng)新一輪復(fù)制。,.,成千上萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子看似在“同一起跑線上”，其實(shí)每個(gè)復(fù)制子發(fā)動(dòng)復(fù)制的先后時(shí)序有很大的差別。而且這種時(shí)序的差別明顯地表現(xiàn)在同一染色體的不同復(fù)制子之間，表現(xiàn)在不同類型的細(xì)胞之間。,.,將啤酒酵母中克隆到的復(fù)制起點(diǎn)序列（ori）構(gòu)建成一個(gè)環(huán)狀的DNA分子，再導(dǎo)入到酵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)它可以啟動(dòng)環(huán)狀的DNA分子自主復(fù)制，將這段富含AT堿基并在不同復(fù)制子中較為保守的序列稱為自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）。,.,果蠅受精后可檢測(cè)處于開放狀態(tài)的ARS從5000個(gè)上升到50000個(gè)，發(fā)育早起的復(fù)制子的長(zhǎng)度僅有7.9kb，而發(fā)育到成蟲時(shí)復(fù)制子的長(zhǎng)度可以增加到40kb，可見此時(shí)許多ARS已處于關(guān)閉狀態(tài)。,.,盡管這種調(diào)控的機(jī)制目前還不甚了解，但復(fù)制子變化規(guī)律表明，復(fù)制子的多少與DNA復(fù)制的速度有關(guān)，而完成全基因組的復(fù)制與細(xì)胞、組織及發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，表現(xiàn)了多復(fù)制子復(fù)制啟動(dòng)的非一致性。,.,五DNA復(fù)制的調(diào)控,與基因表達(dá)調(diào)控一樣，DNA復(fù)制調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是起始過(guò)程的轉(zhuǎn)錄激活效率，同時(shí)細(xì)菌的培養(yǎng)試驗(yàn)表明，細(xì)菌的繁殖速率與營(yíng)養(yǎng)條件（特別是氨基酸饑餓狀態(tài)對(duì)復(fù)制的影響），及多種專一性蛋白因子的濃度密切相關(guān)。,.,細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒，相容性質(zhì)粒和不相容性質(zhì)粒之間的差異都表現(xiàn)在復(fù)制起始調(diào)控上，這種調(diào)控機(jī)制是自然選擇中的先后適應(yīng)。對(duì)原核生物DNA復(fù)制調(diào)控研究最為詳盡的是ColE質(zhì)粒。,.,位于復(fù)制起始原點(diǎn)ori上游555nt處有RNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，朝向ori方向轉(zhuǎn)錄RNA。當(dāng)轉(zhuǎn)錄通過(guò)原點(diǎn)ori后RNA被NaseH酶切，產(chǎn)生的3OH為DNA聚合酶提供引物，發(fā)動(dòng)DNA復(fù)制，從某種意義上講RNA的轉(zhuǎn)錄對(duì)DNA復(fù)制是一種正控制的激活過(guò)程。,.,但與此同時(shí)，在原點(diǎn)ori上游445nt處的另一極性單鏈上還有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，背向ori方向轉(zhuǎn)錄RNA，并與RNA分子之間有110nt的互補(bǔ)序列。實(shí)際上RNA作為RNA的反義RNA，以負(fù)控制的方式參與DNA復(fù)制的調(diào)控。,.,RNA/RNA配對(duì)成雙鏈后形成3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而阻止了NaseH對(duì)RNA的酶切，在ori區(qū)域不能形成DNA聚合酶的引物，復(fù)制過(guò)程被抑制。RNA和RNA分子的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)又受到Rop基因的負(fù)控制調(diào)節(jié)。,.,當(dāng)RNA的轉(zhuǎn)錄到達(dá)ori原點(diǎn)下游不遠(yuǎn)的地方時(shí)，使編碼63個(gè)氨基酸的Rom蛋白基因表達(dá)，Rom蛋白在RNA存在的情況下，可限制RNA只轉(zhuǎn)錄到達(dá)100200nt將行終止，不能到達(dá)ori原點(diǎn)，也不能產(chǎn)生DNA聚合酶的引物。當(dāng)RNA的轉(zhuǎn)錄到達(dá)200360nt以后，Rom蛋白又會(huì)促進(jìn)RNA與RNA互補(bǔ)形成雙鏈。,.,但當(dāng)RNA超過(guò)360nt以后，雖然RNA和RNA之間也可形成雙鏈，但此時(shí)的雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)并不影響NaseH對(duì)RNA的酶切和引物的形成。由此可見，Rom蛋白對(duì)復(fù)制調(diào)控是通過(guò)RNA/RNA形成特異二級(jí)結(jié)構(gòu)而體現(xiàn)的，而且這種調(diào)控也只是在RNA轉(zhuǎn)錄的特定時(shí)刻才具有效應(yīng)。,.,第四節(jié)線性DNA復(fù)制避免5端短縮的機(jī)制,一、T7噬菌體方式共聯(lián)體假說(shuō)1972年J.D.Watson根據(jù)從被感染的菌體中分離得到T7噬菌體的串聯(lián)體（concatemer），最終提出線性DNA避免5端短縮的共聯(lián)體假說(shuō)。這一假說(shuō)認(rèn)為在線狀DNA分子在5末端的單鏈缺口處互補(bǔ)，形成共聯(lián)體。現(xiàn)已證明T7噬菌體全基因組有39936bp，在編碼的41個(gè)基因中，已鑒定了的34個(gè)基因產(chǎn)物，確定了26個(gè)基因的功能。,.,復(fù)制起點(diǎn)位于距離端點(diǎn)17%處。在線狀DNA分子的兩端具有同源性很高的167bp的正向重復(fù)序列（豐足末端），其中有一個(gè)RNase切點(diǎn)。,.,當(dāng)兩條子代DNA合成出后，隨即在被切除引物RNA的缺口處互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈，RNase在切點(diǎn)處進(jìn)行錯(cuò)位酶切產(chǎn)生3OH并游離處部分單鏈模板。DNA聚合酶即可利用3OH末端缺口的補(bǔ)齊。,.,二、腺病毒2方式,腺病毒2（adenovirus2）是一種較大的線狀DNA病毒，其基因組全長(zhǎng)為35937bp，線狀DNA分子兩端具有103106bp，富含AT并且第一個(gè)核苷酸對(duì)為C/G的反向重復(fù)序列（），其中包含50bp的復(fù)制起點(diǎn)。DNA的復(fù)制按單鏈置換式（standdisplacement）分別先后從兩個(gè)末端起始。,.,一種相對(duì)分子質(zhì)量為8.0104的末端結(jié)合前體蛋白（preterminalprotein，pTP）被剪接為成熟的相對(duì)分子質(zhì)量為5.0104的末端結(jié)合蛋白（TP）后，與單鏈結(jié)合蛋白（SSB）一起結(jié)合病毒DNA的3末端。,.,在完成一條子代DNA分子復(fù)制后，被置換的另一條DNA分子以其IR序列配對(duì)形成“鍋柄式”（panhandle）的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，鍋柄處的部分雙鏈結(jié)構(gòu)在TP，pTPSerdGMP等因子的作用下按同樣的方式完成DNA的復(fù)制。,.,腺病毒按這種方式構(gòu)成復(fù)制起始復(fù)合體中不需要引發(fā)酶合成的RNA引物，從而避免了5末端切除引物分子后形成5端短縮形象。,.,三、痘病毒方式,痘病毒（poxvirus）雙鏈DNA分子的兩端具有閉合的環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)。DNA復(fù)制從中部原點(diǎn)起始，雙方向展開，使末端發(fā)夾部分轉(zhuǎn)換為雙鏈，并使兩條雙鏈DNA分子連接成類似于雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的共聯(lián)體。,.,核酸酶從雙鏈分子內(nèi)部進(jìn)行錯(cuò)切，共聯(lián)體解體，游離出包含有末端反向重復(fù)序列的單鏈，末端自行折疊，連接成兩條雙鏈痘病毒DNA分子。,.,四、微小病毒方式,微小病毒（parvovirus）是嚙齒動(dòng)物的單鏈線狀DNA病毒，基因組大小為4800bp，具有重疊基因但只編碼3個(gè)蛋白質(zhì)。雖然微小病毒DNA的復(fù)制全部利用宿主的所有酶系統(tǒng)并與寄主同步，但微小病毒單鏈線狀DNA的兩端結(jié)構(gòu)的特異性決定了其在避免5端短縮機(jī)制上的特殊模式。,.,在微小病毒單鏈線狀DNA的兩端各自一段序列不同的反向重復(fù)序列，這一結(jié)構(gòu)導(dǎo)致5和3端折疊，各自形成一段短的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。復(fù)制啟動(dòng)時(shí)，DNA聚合酶可直接利用3OH，以單鏈DNA分子為模板，合成出一條完整的雙鏈發(fā)卡分子。,.,核酸酶進(jìn)而在模板鏈中的反向重復(fù)序列處切割，DNA聚合酶再行利用暴露的3OH，以游離出包含反向重復(fù)序列5末端為模板，合成出一條完整的雙鏈DNA分子，兩端的反向重復(fù)序列可再次形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)新一輪的DNA復(fù)制。,.,五、真核生物方式端粒的形成與端粒酶(telomerase),端粒（telomere）:真核生物線性染色體3末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。這些重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列，長(zhǎng)度515kb。作用：保護(hù)染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解；解決染色體復(fù)制時(shí)末端丟失問(wèn)題。,.,.,端粒酶（telomerase）,端粒酶（Telomerase）:是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用。它可以其RNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。,初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對(duì)此的一個(gè)推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問(wèn)題的解決無(wú)疑會(huì)有助于對(duì)生命衰老的認(rèn)識(shí)。,端粒酶,.,1995年，JunliFeng等克隆了人類端粒酶RNA基因，長(zhǎng)約450個(gè)堿基的RNA序列中有一段長(zhǎng)11個(gè)核苷酸的區(qū)域（5-CUAACCCUAAC-3）與人的端粒序列（TTAGGG）n互補(bǔ)。端粒酶蛋白質(zhì)的分離：四膜蟲端粒酶兩個(gè)多肽成分p80和p95。,.,端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制,.,.,.,端粒合成的一種模型,整合和雜交,.,端粒與衰老,實(shí)驗(yàn)：在無(wú)端粒酶活性的成纖維細(xì)胞中表達(dá)端粒酶時(shí)，端粒的縮短和細(xì)胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細(xì)胞的衰老是由端粒驅(qū)動(dòng)的。體外培養(yǎng)的細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度隨細(xì)胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對(duì)染色體的保護(hù)作用。細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡。,.,可把端?？闯梢幻骁?，端粒的長(zhǎng)度是鐘上的刻度，記載了細(xì)胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時(shí)鐘”，可通過(guò)測(cè)定端粒的長(zhǎng)度預(yù)測(cè)細(xì)胞的壽命。胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度并不隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無(wú)限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。,.,端粒酶與腫瘤,人體內(nèi)除了生殖細(xì)胞和少數(shù)一些體細(xì)胞如淋巴細(xì)胞等細(xì)胞外，絕大多數(shù)體細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中能檢測(cè)到端粒酶的活性。腫瘤的端粒長(zhǎng)度很短，其繼續(xù)縮短導(dǎo)致染色體融合、細(xì)胞死亡，而端粒酶的激活可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達(dá)可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。,.,端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。,.,第五節(jié)基因突變與DNA的損傷和修復(fù),作為一種能決定生命狀態(tài)存在和延續(xù)的生物大分子，DNA在遺傳過(guò)程中必需保持高度的精確性和完整性，而且這種性能是細(xì)胞中任何一種分子都無(wú)法與之相比的。盡管如此，在DNA復(fù)制過(guò)程中，仍難免會(huì)存在少量未被校正的差錯(cuò)。此外，DNA還會(huì)受到各種物理和化學(xué)因素的損傷。,.,這些差錯(cuò)和損傷如果不被修復(fù)，將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞學(xué)后果，因?yàn)镈NA分子本身是無(wú)法替代的，一個(gè)細(xì)胞通常只有1-2套基因組DNA，而不像蛋白質(zhì)和RNA分子那樣，能利用DNA中的遺傳信息不斷產(chǎn)生新的分子來(lái)替代受損傷的分子。,.,維護(hù)DNA遺傳信息的穩(wěn)定性對(duì)生物細(xì)胞來(lái)說(shuō)是極其重要的。在漫長(zhǎng)的生命進(jìn)化過(guò)程中，生物體不僅演化出能糾正復(fù)制錯(cuò)誤的“校正”系統(tǒng)，而且在細(xì)胞中形成了多種多樣的DNA修復(fù)系統(tǒng)，能對(duì)各種DNA的損傷進(jìn)行修復(fù)，恢復(fù)DNA正常的超螺旋結(jié)構(gòu)，以保持每個(gè)世代遺傳信息的穩(wěn)定性。,.,極少數(shù)不能修復(fù)的DNA損傷將會(huì)導(dǎo)致基因的突變。突變是遺傳物質(zhì)發(fā)生了可遺傳的改變，而這種改變可以發(fā)生在染色體水平和基因水平上。其中一部分突變將有利于物種的進(jìn)化，而另一部分突變將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變異和死亡。,.,一.DNA的損傷,由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)、鏈的斷裂、重組等。引起DNA損傷突變的因素如下,.,（一）自發(fā)因素1脫嘌呤和脫嘧啶在生理?xiàng)l件下，DNA分子通過(guò)自發(fā)水解經(jīng)常發(fā)生脫嘧啶和脫嘌呤反應(yīng)，使嘌呤堿和嘧啶堿從DNA分子的脫氧核糖-磷酸骨架上脫落下來(lái)。例如，在腺嘌呤和鳥嘌呤的N-9及脫氧核糖C-1之間的N-糖苷鍵常發(fā)生自發(fā)水解反應(yīng)而斷裂，從而失去嘌呤堿基，使該嘌呤堿基所編碼的遺傳信息丟失。,.,Lindahl估計(jì)，一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在37條件下，20小時(shí)內(nèi)通過(guò)自發(fā)水解可從DNA鏈上脫落約10000個(gè)嘌呤堿和500個(gè)嘧啶堿。在一個(gè)長(zhǎng)壽命的非復(fù)制的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如人的神經(jīng)細(xì)胞）的整個(gè)生活中自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108個(gè)嘌呤堿，它們占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。每個(gè)細(xì)胞每小時(shí)脫去的嘌呤堿和嘧啶堿分別約為580個(gè)和29個(gè)。自發(fā)脫嘧啶反應(yīng)一般頻率很低。,.,2堿基的脫氨基作用堿基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）都含有環(huán)外氨基，氨基有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，從而使胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ║），腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤（I）,鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤（X）。這些脫氨基產(chǎn)物的配對(duì)性質(zhì)與原來(lái)的堿基不同，即U與A配對(duì)，I和X均與C配對(duì)。而且DNA復(fù)制時(shí)，它們將會(huì)在子鏈中產(chǎn)生錯(cuò)誤而導(dǎo)致DNA損傷。,.,例如，胞嘧啶自發(fā)水解脫氨變成尿嘧啶后，如果未被修復(fù)，產(chǎn)生的尿嘧啶會(huì)在接下來(lái)的復(fù)制中與腺嘌呤配對(duì)，從而產(chǎn)生點(diǎn)突變。DNA分子以這種方式產(chǎn)生尿嘧啶很可能就是DNA含有胸腺嘧啶而不是尿嘧啶的原因。因?yàn)檫@樣可使DNA分子中發(fā)現(xiàn)的任何尿嘧啶，均可被一種稱為尿嘧啶DNA糖化酶所切除，并由胞嘧啶所替代。胞嘧啶自發(fā)脫氨基成為尿嘧啶的頻率估計(jì)約為每小時(shí)每個(gè)細(xì)胞次，即每天每個(gè)細(xì)胞次。,.,3堿基的互變異構(gòu)DNA中的四個(gè)堿基都可能自發(fā)地使氫原子改變位置而產(chǎn)生互變異構(gòu)體，從而使堿基的配對(duì)形式發(fā)生改變。如腺嘌呤的稀有互變異構(gòu)體與胞嘧啶配對(duì)，胸腺嘧啶的稀有互變異構(gòu)體與鳥嘌呤配對(duì)。當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，如果模板鏈上存在著這樣形式的互變異構(gòu)體，在子鏈上就可以產(chǎn)生錯(cuò)誤，造成DNA損傷。,.,例如稀有堿基腺嘌呤和胞嘧啶，或稀有堿基胸腺嘧啶與鳥嘌呤形成氫鍵，便可導(dǎo)致下一世代中G-C配對(duì)取代A-T配對(duì).?4細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對(duì)DNA的損傷在所有需氧細(xì)胞中，細(xì)胞呼吸作用產(chǎn)生的副產(chǎn)物超氧陰離子（O2-）和H2O2非常活躍.由于這些超氧化物、氫過(guò)氧化物及羥基自由基（OH）等活性氧的存在，導(dǎo)致DNA在正常條件下發(fā)生氧化損傷。,.,這些自由基可在許多位點(diǎn)上攻擊DNA，產(chǎn)生一系列特性變化了的氧化產(chǎn)物，如8-氧化鳥嘌呤、2-氧化腺嘌呤和5-羥甲基尿嘧啶等。電離輻射引起水分解所產(chǎn)生的羥基自由基，會(huì)提高這些氧化產(chǎn)物的水平。氧自由基對(duì)DNA的損傷是由金屬離子，尤其是鐵離子所介導(dǎo)的，因此，螯合劑、自由基清除劑、超氧化物歧化酶、二氧化物酶和過(guò)氧化物酶活力的增強(qiáng)，都能降低氧自由基的毒性。,.,此外，葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，可能還有其他的糖分子也能和DNA反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)改變，這些改變的累積可導(dǎo)致細(xì)胞老化。除上述自發(fā)性損傷外，DNA分子還會(huì)自發(fā)產(chǎn)生單鏈斷裂、鏈間交聯(lián)和形成一些甲基加合物等。,.,（二）物理因素由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。物理的誘變損傷因素可分為電離輻射和非電離輻射兩大類。,.,電離輻射因素,電離輻射的誘變損傷因子主要是由Co60、Cs137發(fā)生的X射線和射線，由H3發(fā)生的射線，由P32、S35發(fā)生的射線等.盡管各類射線能量以及對(duì)生物組織和細(xì)胞的穿透能力各不相同，但離子射線導(dǎo)致基因