微生物遺傳學(xué)三

第五節(jié)微生物的誘變育種,一、誘變育種中的幾個(gè)原則,指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物群體細(xì)胞，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后設(shè)法從中選取少數(shù)符合育種目的的突變株。,2個(gè)主要環(huán)節(jié)：,誘變（隨機(jī)）,選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中的突變頻率大大提高。,篩選（定向）,設(shè)計(jì)有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來。,（一）出發(fā)菌株（originalstrain）,出發(fā)菌株指用于誘變育種的起始菌株。,具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求粗放、標(biāo)記明顯等）；對(duì)誘變劑敏感,野生型菌株；從生產(chǎn)中選育的自發(fā)突變菌株；誘變獲得的高產(chǎn)菌株,出發(fā)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)：,出發(fā)菌株的來源：,（二）菌懸液的制備,1.選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）,目的：使每個(gè)細(xì)胞能均勻接觸誘變劑；減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）,2.同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）,3.菌齡：對(duì)誘變劑最敏感時(shí)期營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞：對(duì)數(shù)期孢子或芽孢：萌發(fā)前期,4.菌懸液的制備方法物理誘變：生理鹽水配制化學(xué)誘變：緩沖液配制,5.菌懸液的濃度酵母菌，霉菌的孢子：106個(gè)/mL細(xì)菌，放線菌孢子：108個(gè)/mL,（三）誘變劑的選擇及處理方法,1.誘變劑的選擇（高效，簡(jiǎn)便）,物理誘變劑：頻度低，大損傷，難修復(fù)，且操作簡(jiǎn)便；化學(xué)誘變劑：頻度高，點(diǎn)突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。(NTG超誘變劑）,UV是最常用的一種誘變劑,2.劑量的選擇,突變率隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量,反而會(huì)使突變率下降。正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。,在產(chǎn)量變異工作中，常采用相對(duì)殺菌率為7075%,甚至3070%的劑量。,UV的劑量:固定UV功率和照射距離,以照射時(shí)間長(zhǎng)短來確定劑量多少。,最適劑量：在提高突變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能使變異向正突變范圍移動(dòng)的劑量。,常以殺菌率來表示相對(duì)劑量（劑量-存活率曲線）,3.誘變處理方法,單因素處理或多因素的復(fù)合處理：同一誘變劑的重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用.,（四）中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）,目的：克服表型延遲,表型延遲（phenotypiclag）：表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.分離性延遲：突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。生理性延遲：由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能表現(xiàn)出來。,分離性延遲的原因:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，誘變對(duì)數(shù)期的細(xì)胞時(shí)，突變通常發(fā)生在一個(gè)核上，故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。,生理性延遲的原因:當(dāng)變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí),由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。,生理性延遲:,（五）突變株的篩選,初篩復(fù)篩,1.初篩（以量為主）,（1）利用形態(tài)變異：需預(yù)先測(cè)定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性,（2）根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；抑菌圈法（抗生素）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）,2.復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測(cè)定）,搖瓶培養(yǎng)，直接檢測(cè)所需產(chǎn)物,方法需簡(jiǎn)便、快速,2步,誘變育種的基本原則：,選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑；挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株；處理單細(xì)胞或單孢子懸液；選用最適的誘變劑量；充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)；利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)；設(shè)計(jì)高效篩選方案；創(chuàng)造新型篩選方法。,二、幾種重要突變株的篩選方法,1.抗性突變株的篩選(1)抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選(2)抗藥性突變株篩選2.營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選,1.抗性突變株的篩選（1）抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物的突變株用途：篩選相應(yīng)代謝物的高產(chǎn)菌株（2）抗藥性突變株用途：篩選相應(yīng)藥物(抗生素)的高產(chǎn)菌株或遺傳標(biāo)記制作篩選的方法:a.高于臨界濃度的平板進(jìn)行分離；b.梯度平板法,敏感菌苔,抗性菌落,加入含異煙肼的上層,加入不含異煙肼的底層,所謂結(jié)構(gòu)類似物（又稱代謝拮抗物）是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物（氨基酸、嘌呤、維生素等）相似的物質(zhì)。如：異煙肼（“雷米封”）是吡哆醇的結(jié)構(gòu)類似物，利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株，可達(dá)到定向培育吡哆醇高產(chǎn)突變株的目的。為什么在篩選突變株時(shí),不能直接用代謝產(chǎn)物,而必須用其結(jié)構(gòu)類似物?,2.營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選,（1）幾個(gè)概念：,三類培養(yǎng)基：,基本培養(yǎng)基（MM,minimalmedium）-：,某野生型能生長(zhǎng)的最低成分的組合培養(yǎng)基。,完全培養(yǎng)基（CM,completemedium）+：,各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型能生長(zhǎng)的天然或半組合培養(yǎng)基,補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM,supplementalmedium）A:-+AB:-+B,相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型能生長(zhǎng)的組合或半組合培養(yǎng)基,三種遺傳型：,野生型（wildtype）,從自然界分離到的、發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。A+B+,可在-生長(zhǎng)。,營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）,野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。A+B-：能在+、B生長(zhǎng)A-B+：能在+、A生長(zhǎng)A-B-：能在+生長(zhǎng),原養(yǎng)型（prototroph）,營(yíng)養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組，回到原來野生型的營(yíng)養(yǎng)要求A+B+,可在-生長(zhǎng),（2）篩選步驟（5步）,誘變處理,中間培養(yǎng),淘汰野生型,檢出缺陷型,鑒定缺陷型,中間培養(yǎng),CM或SM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜?？朔硇脱舆t。,淘汰野生型,即濃縮缺陷型，以提高檢出率,方法抗生素法（G+細(xì)菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌）,饑餓培養(yǎng)（無N）MM612h2N培養(yǎng)(2N)MM12h加抗生素(或菌絲過濾)，培養(yǎng)過夜,營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出,方法,夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法影印平板法,營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定,生長(zhǎng)譜法：,快速，直觀,分兩步：,a.三大類營(yíng)養(yǎng)要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.具體到某一種營(yíng)養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種維生素,或哪一種堿基),具體操作:一般采用“濾紙片法”,a.不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液或蛋白胨b.水溶性維生素混合液c.0.1%堿水解酵母核酸液,a,b,c,三大類營(yíng)養(yǎng)要求的鑒定：,以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明將18種氨基酸按右表分為6組特點(diǎn)：每2組只有一種共同物質(zhì),單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求的鑒定：,1,3,5,2,4,6,（3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途生產(chǎn)菌(氨基酸、核苷酸、維生素等高產(chǎn)菌需求)；研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化等遺傳規(guī)律的遺傳標(biāo)記。,誘變育種的程序：實(shí)驗(yàn)講義p174出發(fā)菌株（純化）前培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期）菌懸液制備活菌計(jì)數(shù)誘變預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劑量存活率曲線）誘變處理（相對(duì)殺菌率為70-75%，30-70%）活菌計(jì)數(shù)中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜，克服表型延遲）突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗(yàn)菌種（鑒定與）保藏,1.從生產(chǎn)中選育2.定向培育優(yōu)良品種一般指用特定因素長(zhǎng)期處理微生物群體，同時(shí)不斷地對(duì)它們進(jìn)行移種傳代，以達(dá)到積累并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。例：卡介苗（牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒活菌苗）,三、自發(fā)突變與育種,第六節(jié)原核生物的基因重組,基因重組（generecombination）：將兩個(gè)不同性狀個(gè)體的基因通過一定的方式轉(zhuǎn)移到一起，并發(fā)生重新組合，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程，稱為基因重組(generecombination)或遺傳重組。重組：遺傳物質(zhì)在分子水平上發(fā)生的交換；雜交：在細(xì)胞水平上遺傳物質(zhì)的交換.雜交必然包含著重組，但重組不僅限于雜交這一形式。,原核生物的基因重組類型,4種形式：1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）接合4）原生質(zhì)體融合,一、轉(zhuǎn)化（transformation）,定義：受體細(xì)胞直接吸收供體細(xì)胞的DNA片段,并與其染色體同源片段進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換，從而使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象。,轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。,目前已知有二十多個(gè)種的G+和G-細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。,自然遺傳轉(zhuǎn)化（naturalgenetictransformation）,人工轉(zhuǎn)化（artificialtransformation）,感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞,1.感受態(tài),感受態(tài)：是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。一個(gè)細(xì)菌能否出現(xiàn)感受態(tài)是由其遺傳性決定的，但受環(huán)境條件的影響也很大，因而表現(xiàn)差別很大。,感受態(tài)因子：調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白，它包括三種主要成分：膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶。,自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？,自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性（如肺炎鏈球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）受細(xì)菌自身的基因控制,人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。（該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)?。?進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：,（1）建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞,（2）外源游離DNA分子,感受態(tài)的機(jī)理研究：,局部原生質(zhì)體化假說：處于感受態(tài)的細(xì)胞局部失去了細(xì)胞壁，使外源DNA能順利經(jīng)膜進(jìn)入菌體。,酶受體假說：受體細(xì)胞表面出現(xiàn)了一種能結(jié)合DNA并使之進(jìn)入細(xì)胞的酶。,2.轉(zhuǎn)化模型,（1）轉(zhuǎn)化因子本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞前還會(huì)被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.革蘭氏陰性的嗜血桿菌中，細(xì)胞只吸收dsDNA形式的轉(zhuǎn)化因子，但進(jìn)入細(xì)胞后需經(jīng)酶解為ssDNA，才能與受體菌的基因組整合；革蘭氏陽性的鏈球菌和芽孢桿菌中，dsDNA的一條鏈必