干擾素制備的工藝流程PPT課件VIP

干擾素的制備流程 干擾素 什么是干擾素 概念 interferon IFN 機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子 是機(jī)體受到病毒感染時 免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似 功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為 等4個類型 干擾素又依其結(jié)構(gòu)分為 1b 2a 2b等亞型其區(qū)別在于個別氨基酸的差異上 早期干擾素是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的 產(chǎn)量低 價格昂貴 不能滿足需要 現(xiàn)在可利用基因工程技術(shù)并在大腸桿菌中發(fā)酵 表達(dá)來進(jìn)行生產(chǎn) 基因工程菌的制備 目的基因的分離目的基因與克隆重組導(dǎo)入大腸桿菌K12克隆載體載體的體外重組受體菌的培養(yǎng)從受體菌中獲取目的基因及篩選重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌受體菌的篩選 表達(dá)性 穩(wěn)定性等檢測 工程菌 目的基因的分離與獲得 重組體引入宿主細(xì)胞 提取重組質(zhì)粒 質(zhì)粒DNA的純化 目的基因與克隆載體進(jìn)行體外重組 從大腸桿菌K12獲取目的基因 對重組質(zhì)粒的檢測與目的基因提取 目的基因與表達(dá)載體的組合與導(dǎo)入 工藝流程 目的基因的分離與獲得 設(shè)計(jì)合成干擾素基因的兩端引物 完全的 每條引物內(nèi)或5 端最好有內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) 1 有藥物誘導(dǎo)細(xì)胞 如佛波酯 使細(xì)胞表達(dá)干擾素升高 2 破碎細(xì)胞 提取細(xì)胞總mRNA 3 4 5 用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄 把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 以cDNA為模板 干擾素引物為引物 PCR 得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物 目的基因與克隆載體進(jìn)行體外重組 1 提取載體 質(zhì)粒 病毒等 雙酶切 再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的酶酶切 用連接酶連接2 連接完成后分離純化 測序 與原干擾素序列比對 3 鑒定序列無誤后 無義突變也行 導(dǎo)入受體細(xì)胞 篩選 重組體引入宿主細(xì)胞 將cDNA克隆到含有四環(huán)素 氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pBR322中 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 形成攜帶質(zhì)粒的菌株 從大腸桿菌K12獲取目的基因 由于質(zhì)粒重組時有3種基本方式 即 目的基因與克隆載體重組 目的基因片段與目的基因片段重組 克隆載體與克隆載體重組 另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況流程 步驟一 將細(xì)菌涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 就可得到質(zhì)粒PBR322或重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落 步驟二 步驟一獲得的每一個細(xì)菌單菌落標(biāo)記為a b c d等 在每一個單菌落中挑取部分細(xì)菌轉(zhuǎn)涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上 不能生長的是絕大部分含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌及少量可能發(fā)生突變的非重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落 原因 因?yàn)镻BR322含有抗四環(huán)素基因 重組質(zhì)粒中目的基因插在抗四環(huán)素基因中 使其結(jié)構(gòu)破壞 失去抗四環(huán)素作用 提取重組質(zhì)粒 1 對上一步獲得含目的基因的大腸桿菌在含有氯霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)15h 培養(yǎng)時間 前人實(shí)驗(yàn)證實(shí)大腸桿菌K12生長前6h為遲緩期 6 15 5h為對數(shù)增時期 15 5 19 5h為穩(wěn)定期 19 5h后為衰亡期 氯霉素 氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成 結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制 然而 松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制 2 細(xì)菌的收獲和裂解1 用合適轉(zhuǎn)頭于4 以4000轉(zhuǎn) 分離心15分鐘 棄上清 敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡 2 將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中 STE0 1mol LNaCl10mmol LTris Cl Ph8 0 1mmol LEDTA Ph8 0 按步驟1 所述方法離心 以收集細(xì)菌細(xì)胞 3 堿裂解法1 將洗過的500ml培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物 來自收獲細(xì)菌的步驟3 重懸于10ml 18ml 溶液 中 溶液 50mmol L葡萄糖25mmol LTris Cl Ph8 0 10mmol LEDTA Ph8 0 溶液 可分批配制 在101bf in2 6 895x104Pa 高壓下蒸汽滅菌15分鐘 貯存于4 2 加1ml 2ml 新配制的溶菌酶溶液 10mg ml 溶于10mmol LTris Cl Ph8 0 當(dāng)溶液的pH值低于8 0時 溶菌酶不能有效工作 3 加20ml 40ml 新配制的溶液 溶液 0 2molLNaOH 臨用前用10molL貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋 1 SDS蓋緊瓶蓋 緩緩顛倒離心瓶數(shù)次 以充分混勻內(nèi)容物 于室溫放置5 10分鐘 提取重組質(zhì)粒 提取重組質(zhì)粒 4 加15ml 20ml 用冰預(yù)冷的溶液 溶液 5mol L乙酸鉀60ml冰乙酸11 5ml水28 5ml所配制的的溶液對鉀是3mol L 對乙酸跟是5mol L 封住瓶口 搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物 此時應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個液相 置冰上放10分鐘 應(yīng)形成一白色絮狀沉淀 于0 放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA 高分子量RNA和鉀 SDS 蛋白質(zhì) 膜復(fù)合物 5 用合適轉(zhuǎn)頭于4 以4000轉(zhuǎn) 分離心15分鐘 不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn) 如果細(xì)菌碎片貼壁不緊 可以5000轉(zhuǎn) 分再度離心20分鐘 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中 棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體 未能形成致密沉淀塊原因通常是由于溶液 與細(xì)菌裂解物混合不充分 6 上清過濾至一250ml離心瓶中 加0 6體積的異丙醇 充分混勻 于室溫放置10分鐘 提取重組質(zhì)粒 7 用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以5000轉(zhuǎn) 分離心15分鐘 回收核酸 如于4 離心 鹽也會生成了沉淀 8 小心倒掉上清 敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡 于室溫用70 乙醇洗滌沉積管壁 倒出乙醇 用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴 于室溫將瓶倒置在紙巾上 使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡 9 用3mlTE pH8 0 溶解核酸沉淀 10 純化 一 聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA1 將核酸溶液所得轉(zhuǎn)入15mlCorex管中 再加3ml用冰預(yù)冷的5mo1 LLiCl溶液 充分混勻 用合適轉(zhuǎn)頭于4 下以10000轉(zhuǎn) 分離心I0分鐘 LiCI可沉淀高分子RNA 2 將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi) 加等量的異丙醇 充分混勻 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭 或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖 于室溫以10000轉(zhuǎn) 分離心10分鐘 回收沉淀的核酸 3 小心去掉上清 敞開管口 將管倒置以使最后殘留的液滴流盡 于室溫用70 乙醇洗滌沉淀及管壁 流盡乙醇 用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴 敞開管口并將管倒置 在紙巾上放置幾分鐘 以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡 4 用500 l含無DNA酶的胰RNA酶 20 g ml 的TE pH8 0 溶解沉淀 將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中 于室溫放置30分鐘 5 加500 l含13 w v 聚乙二醇 PEG8000 的1 6mol LNaCI 充分混合 用微量離心機(jī)于4 以12000g離心5分鐘 以回收質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒DNA的純化 6 吸出上清 用400 lTE pH8 0 溶解質(zhì)粒DNA沉淀 用酚 酚 氯仿 氯仿各抽l次 7 將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中 加100 l10mol L乙醇銨 充分混勻 加2倍體積 約lml 乙醇 于室溫放置10分鐘 于4 以12000g離心5分鐘 以回收沉淀的質(zhì)粒DNA 8 吸去上清 加200 l處于4 以12000g離心2分鐘 9 吸去上清 敞開管口 將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡 10 用500 lTE pH8 0 溶解沉淀1 100稀釋 用TE pH8 0 后測量0D260 計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度 10D260 50 g質(zhì)粒DNA ml 然后將DNA貯于一20 質(zhì)粒DNA的純化 對重組質(zhì)粒的檢測與目的基因提取 目的基因獲取對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切 獲得目的基因與PBR322質(zhì)粒片段 通過瓊脂糖凝膠電泳 由于目的基因與PBR322質(zhì)粒片段相對分子量不同 在電泳過程中產(chǎn)生不同的條帶 通過與已知基因長度的對比 我們可以選出相應(yīng)的目的基因 接著利用Qiagen純化柱回收純化DNA 具體 用3倍體積的特殊高鹽溶液于55 融化帶有目的基因的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊 將DNA釋放到水溶液中 然后將其通過Qiagen純化柱 經(jīng)過 結(jié)合一洗滌一洗脫 步驟 直接得到純化的DNA樣品 利用核酸探針雜交法鑒定目的基因 目的基因與表達(dá)載體的組合與導(dǎo)入 表達(dá)載體 PBV220 將PBV220和目的基因用雙酶切法處理 退火后連接 構(gòu)建重組質(zhì)粒 利用CaCl2法導(dǎo)入到宿主大腸桿菌中 構(gòu)建工程菌 在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 利用干擾素性質(zhì)鑒定目的工程菌 分離工程菌 擴(kuò)大培養(yǎng) 提取出質(zhì)粒 分析質(zhì)粒穩(wěn)定性 干擾素的發(fā)酵工藝過程 啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品鑒定分裝凍干成品檢定成品包裝 l 菌種制備取一70 下保存的甘油管菌種 工作種子批 于室溫下融化 然后 接入搖瓶 培養(yǎng)溫度30 pH7 0 250r min活化培養(yǎng)18 2小時后 進(jìn)行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查 2 種子罐培養(yǎng)將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中 接種量10 培養(yǎng)溫度30 pH7 0 級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 控制溶解氧為30 培養(yǎng)3 4小時 轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中 同時取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查 控制雜菌 3 發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中 接種量10 培養(yǎng)溫度30 pH7 0 級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 控制溶解氧30 培養(yǎng)4小時 然后控制培養(yǎng)溫度20 pH6 0 溶解氧60 繼續(xù)培養(yǎng)5 6 5小吋 同時進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查 當(dāng)0D值達(dá)9 0 1 0后 用5 冷卻水快速降溫至15 以下 以減緩細(xì)胞衰老 或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中 加入冰塊使溫度迅速降至10 以下 4 菌體收集將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī) 16000r min離心收集 進(jìn)行干擾素含量 菌體蛋白含量 菌體干燥失重 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性 質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測 菌體于一20 冰柜中保存時 不得超過12個月 每保存3個月 檢查一次活性 干擾素發(fā)酵過程控制 在假單孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中 菌體在培養(yǎng)1 5小時分裂速度最快 到3 5小時開始下降 而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3 5小時之后 在4小時達(dá)到最大 然后由于降解而迅速下降 可見在發(fā)酵生產(chǎn)工藝中 假單孢桿菌的生長和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài) 可采用兩段培養(yǎng)的策略進(jìn)行過程控制 l 溶解氧控制分別在生長階段和生產(chǎn)階段采用各自最佳溶解氧濃度 以期提高干擾素的發(fā)酵水平 通過級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速得以實(shí)現(xiàn) 2 溫度控制假單孢桿菌生長最適溫度與產(chǎn)物形成最適溫度是不同的 產(chǎn)物合成溫度控制在20 可以有效防止干擾素 2b的降解 而其最佳生長溫度則為30 質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速下降 因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標(biāo)產(chǎn)物的降解 增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性 3 pH值發(fā)酵過程中 pH的變化由工程菌的代謝 培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定 干擾素 的等電點(diǎn)在pH6 0附近 在低酸性條件下穩(wěn)定 能耐受pH2 5的酸性環(huán)境 因此可在發(fā)酵后期降低pH 從而造成大量蛋白酶失活減少干擾素 的水解 提高干擾素的積累量 半成品檢定 l 效價測定用細(xì)胞病變抑制法 以Wish細(xì)胞VSV病毒為基本檢測系統(tǒng) 測定中必須用國家或國際參考品校準(zhǔn)為國際單位 2 蛋白質(zhì)含量測定福林 酚法 以中國藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn) 3 比活性效價的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比 4 純度電泳純度用非還原型SDS PAGE法 銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶 經(jīng)掃描儀測定純度應(yīng)在95 以上 5 相對分子量測定還原型SDS PAGE 加樣量不低于微克 同時用已知相對分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對照 以遷移率為橫坐標(biāo) 相對分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖 計(jì)算相對分子量 與理論值比較 誤差不得高于10 6 殘余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定 每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg 7 殘余血清lgG含量測定在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法吋必須進(jìn)行此項(xiàng)檢定 8 殘余抗生素活性測定半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在 9 紫外光譜掃描檢查半成品的光譜吸收值 最大吸收值應(yīng)在280 2納米 10 肽圖測定用CNBr裂解法 測定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu) 且批與批之間應(yīng)一致 11 等電點(diǎn)測定等電聚焦電泳 12 除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定 無菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn) 成品檢定 1 物理性狀凍干品白色或微黃色疏松體 加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物 2 鑒別試驗(yàn)應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定 3 水分測定用卡氏法 應(yīng)低于3 4 無菌試驗(yàn)同半成品 5 熱原質(zhì)試驗(yàn)同半成品檢定 6 干擾素效價測定同半成品檢定 效價不應(yīng)低于標(biāo)示量 7 安全試驗(yàn)體重為350 400克豚鼠3只 每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍 觀察7天 若豚鼠局部無紅腫 壞死 總體重不下降 說明成品合格 取體重18 20克小鼠5只 每只尾靜脈注劑量按人每千克臨床使用最大量的3倍 觀察7天 若動物全部存活 說明成品合格 問題討論 1 目的基因的獲取為什么用mRNA而不是DNA 基因組 即某種生物一個細(xì)胞內(nèi)全部的DNA信息 將這些DNA打斷 連接到載體上并轉(zhuǎn)入微生物 使這些微生物細(xì)胞內(nèi)含有某生物的全部基因組 那么這些微生物就組成了基因組文庫 以上兩者包含的都是遺傳信息 對于某種生物來說 任何一個細(xì)胞的遺傳信息都是相同的 cDNA是由細(xì)胞內(nèi)的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄的方式獲得的 其包含的一個細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)信息 多細(xì)胞生物的不同細(xì)胞的表達(dá)信息往往是不同