細(xì)胞工程制藥-復(fù)習(xí).doc

一、 緒論干細(xì)胞用途：用于藥物的研究或毒性的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室中研究基因的控制與表達(dá)?？梢杂脕?lái)分化培養(yǎng)一些治療細(xì)胞。（一） 名詞解釋1. 細(xì)胞工程制藥：根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)定向改變細(xì)胞遺傳特征，建立和創(chuàng)建新型細(xì)胞系（株），并通過(guò)專門(mén)的細(xì)胞培養(yǎng)方法研究細(xì)胞生命現(xiàn)象和活動(dòng)規(guī)律，采用工程化的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法，探索生產(chǎn)方法和工藝，制造藥用生化和生物制品。（1）細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) （2）細(xì)胞工程常用技術(shù) （3）細(xì)胞工程制藥應(yīng)用技術(shù)2. 生物工程：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程學(xué)原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的一門(mén)綜合技術(shù)。第一代生物工程 近代生物工程 現(xiàn)代生物工程（1）發(fā)酵工程 （2）酶工程 （3）蛋白質(zhì)工程 （4）基因工程（5）細(xì)胞工程：以細(xì)胞為基本單位或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種或創(chuàng)造新品種；或加速繁育動(dòng)、植物個(gè)體；或獲得某種有用的物質(zhì)的過(guò)程。、植物細(xì)胞工程 、動(dòng)物細(xì)胞工程 、微生物細(xì)胞工程3. 細(xì)胞與組織培養(yǎng)：生物細(xì)胞和組織在離體條件下的生長(zhǎng)和增殖。 體外（in vitro）培養(yǎng)細(xì)胞工程的最基本技術(shù)4. 細(xì)胞核移植：利用顯微操作技術(shù)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離，然后再將不同來(lái)源的核與質(zhì)重組，形成雜種細(xì)胞。5. 胚胎工程：以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行的操作，主要技術(shù)包括體外受精、胚胎切割、胚胎移植等。6. 干細(xì)胞：動(dòng)物體內(nèi)具有分化潛能，并能自我更新的細(xì)胞。（1）胚胎干細(xì)胞：來(lái)自囊胚期的細(xì)胞團(tuán)，屬于全能干細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞可以發(fā)育成為完整的個(gè)體。（2）組織干細(xì)胞：存在于成體組織中，屬單能或多能干細(xì)胞，可以定向分化為一種或幾種不同的組織。7. 細(xì)胞重組：細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合，在融合介子誘導(dǎo)下，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，重新構(gòu)成胞質(zhì)雜種細(xì)胞的過(guò)程。（二） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)志性事件&人物A.Barli 細(xì)胞融合 1859 黏蟲(chóng)生活史首例克隆動(dòng)物成功的報(bào)道 1962 非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核（未受精卵）（三） 脫分化&再分化1. 脫分化：一個(gè)成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過(guò)程?；謴?fù)細(xì)胞的分裂活性。高度分化的細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)后，失去其特定結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞（愈傷組織）的過(guò)程。2. 再分化：經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的過(guò)程。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個(gè)過(guò)程叫做再分化。（四） 植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)細(xì)胞全能性二、 細(xì)胞工程基礎(chǔ)（一） 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置&儀器（6個(gè)分區(qū)）實(shí)驗(yàn)室是細(xì)胞工程研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿足：清洗 培養(yǎng)基制備 滅菌 儲(chǔ)藏?zé)o菌操作 培養(yǎng)；等方面工作。1. 基本實(shí)驗(yàn)室設(shè)置（1）清洗室 （2）制備室 （3）滅菌室 （4）儲(chǔ)藏室（5）無(wú)菌操作室：實(shí)驗(yàn)材料接種操作，又叫接種室。更衣間：鞋帽架、口罩緩沖間：水槽、小型儀器接種間（無(wú)菌間）：超凈工作臺(tái)、紫外燈、接種器械（6）培養(yǎng)室細(xì)胞培養(yǎng)（動(dòng)物、植物）2. 輔助實(shí)驗(yàn)室設(shè)置（1）鑒定室對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究（2）生化分析室分析化驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物（3）溫室馴化移植3. 常用儀器與設(shè)備（二） 實(shí)驗(yàn)室污染1. 污染：混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括微生物和化學(xué)物質(zhì)。（1）細(xì)菌污染表現(xiàn)：變渾濁，pH改變。胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。（2）真菌污染表現(xiàn)：培養(yǎng)液中漂浮著白色小點(diǎn)，一般不渾濁。倒置顯微鏡下可見(jiàn)菌絲排列。念珠菌和酵母菌呈卵形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。（3）支原體污染表現(xiàn)：不易發(fā)現(xiàn)。電鏡下可見(jiàn)其三層結(jié)構(gòu)。部分敏感細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，部分變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)無(wú)明顯變化。（4）病毒污染：采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如沒(méi)除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。（5）非同種細(xì)胞污染（6）非細(xì)胞培養(yǎng)物污染（化學(xué)物質(zhì)）2. 污染的鑒別（1）細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)：肉眼觀察 鏡下觀察 接種觀察（2）支原體污染的檢測(cè)：最常用電鏡觀察（地衣紅染色）3. 污染的清除（1）使用抗生素：預(yù)防比污染后再用好。聯(lián)用比單用好。（2）加溫處理：支原體41（3）使用支原體特異性血清（4）其他方法三、 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（一） 定義1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。 常泛指：所有體外培養(yǎng)的統(tǒng)稱。 分類：器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)2. 細(xì)胞培養(yǎng)：用機(jī)械或化學(xué)的方法將組織分散成單個(gè)細(xì)胞而進(jìn)行的培養(yǎng)。（1） 群體培養(yǎng)：將大量細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長(zhǎng)，形成均勻的單細(xì)胞或單細(xì)胞懸液。（2） 克隆培養(yǎng)：將少數(shù)的細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過(guò)繁殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，稱為克隆。3. 組織培養(yǎng)：把活體的組織取出分成小塊，直接置于培養(yǎng)瓶底或通過(guò)膠原纖維血漿支持物的培養(yǎng)瓶底來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。4. 器官培養(yǎng)：將活體中器官或一部分器官取出，在體外生長(zhǎng)、生存，并使其保持器官原有的結(jié)構(gòu)和功能特征的培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：理化環(huán)境可控。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后特征均一。培養(yǎng)物可直接被觀測(cè)。提供大量均一的細(xì)胞供制備用。便于進(jìn)行人工篩選。缺點(diǎn)：與體內(nèi)環(huán)境仍存一定差異，細(xì)胞形態(tài)或功能會(huì)發(fā)生改變。防止污染、無(wú)菌操作是動(dòng)物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵！動(dòng)物細(xì)胞的特性（和微生物比較）：大，無(wú)細(xì)胞壁。生長(zhǎng)慢，易污染。需氧量少，對(duì)剪切力敏感。以聚集體存在。原代50代死亡。（二） 標(biāo)志性事件Carrel 雞胚浸出液 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng) 無(wú)菌技術(shù)引到組織培養(yǎng)技術(shù)中Thomson 1914 器官培養(yǎng)法Earle 1940 無(wú)限傳代 C3H小鼠的結(jié)締組織細(xì)胞系1. 開(kāi)始：1907 Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液內(nèi)，培養(yǎng)出神經(jīng)元。2. 成熟：以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系。3. 研究?jī)?nèi)容：細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)和流動(dòng)，外界對(duì)其影響，細(xì)胞間互相作用等。4. 關(guān)鍵：無(wú)菌操作。（三） 體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（根據(jù)：形態(tài)特征）1. 貼附型細(xì)胞：（1）成纖維型 （2）上皮型 （3）游走型 （4）多形型2. 非貼附型（懸浮型）細(xì)胞（四） 接觸抑制&密度抑制1. 接觸抑制：細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。2. 密度抑制：培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過(guò)程。（1）游離期 （2）指數(shù)生長(zhǎng)期 （3）穩(wěn)定期 （4）衰退期（五） 培養(yǎng)群體生命圖（六） 原代培養(yǎng)期&傳代培養(yǎng)期1. 原代（初代）培養(yǎng)期：從新鮮供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行首次培養(yǎng)，一般持續(xù)14周。 特點(diǎn)：（1）細(xì)胞移動(dòng)較活躍。（2）異質(zhì)性。（3）細(xì)胞與體內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞性狀相似。 （4）是檢測(cè)藥物的很好實(shí)驗(yàn)工具。2. 傳代培養(yǎng)期：當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞相互匯合時(shí)，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶消化、收集、稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過(guò)程。（七） 細(xì)胞株&細(xì)胞系1. 細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)第一次傳代后，形成的細(xì)胞群體，即具有增殖能力，類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，一般為有限細(xì)胞系。原代培養(yǎng)后得到細(xì)胞系，再經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，一部分細(xì)胞死亡，一部分細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)化為連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。2. 細(xì)胞株：細(xì)胞系經(jīng)過(guò)克隆或其他方法而得的單一類型的細(xì)胞群體。（八） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件1. 培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境：（1）環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌。（2）適宜的溫度：3537。（3）氣體環(huán)境和氫離子濃度：pH7.27.4。（4）滲透壓。（5）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。（6）其它。2. 培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分：（1）氨基酸。（2）鹽類：Na、K、Mg離子。（3）葡萄糖：供能。（4）緩沖系統(tǒng)。（5）生長(zhǎng)因子。（6）其它成分。（九） BBS&常用液1. 天然培養(yǎng)基（血清、血漿、組織浸出液、水解乳蛋白）培養(yǎng)常用溶液：（1）平衡鹽溶液（BSS）：PBS、Ringer 功效：維持滲透壓。提供緩沖系統(tǒng)。提供水分和無(wú)機(jī)鹽。（2）其它常用液：消化液：胰蛋白酶、EDTA、膠原酶溶液。HEPES氫離子緩沖劑：調(diào)節(jié)pH值。NaHCO3溶液：調(diào)節(jié)pH值。抗生素液：防止污染。2. 人工合成培養(yǎng)基：化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，便于重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)化管理和控制。（1） 基本成分：氨基酸、維生素、糖、無(wú)機(jī)離子等。（2） 常用培養(yǎng)液：199培養(yǎng)液、Eagle培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液等。（十） 取材方式1. 分離法2. 消化法（十一） 組織塊培養(yǎng)法&單層細(xì)胞培養(yǎng)法1. 原代培養(yǎng)（1） 原代細(xì)胞的培養(yǎng)：1）取材（幼體較成體、分化程度低較高、腫瘤細(xì)胞較正常易）2）分離：組織塊分離機(jī)械法：切割分離法：適用組織塊培養(yǎng)機(jī)械分離法：適用某些軟組織如腦、胚胎和一些腫瘤等消化法：胰蛋白酶消化法：適用消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織、羊膜、上皮、肝、腎等膠原酶消化法：適用結(jié)締組織螯合劑消化法（EDTA法）：適用消化分離傳代細(xì)胞細(xì)胞懸液分離（血液、羊水、胸水、腹水）：離心法（5001000rpm，510min）（2） 組織塊培養(yǎng)法：粗切細(xì)切沖洗，自然沉降留少許BSS 翻轉(zhuǎn)干涸法（置37溫箱中）繼續(xù)培養(yǎng)移入培養(yǎng)瓶中并吸凈BSS 細(xì)胞生長(zhǎng) 薄層營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法培養(yǎng)24小時(shí)后補(bǔ)液（3） 單層細(xì)胞培養(yǎng)法（消化培養(yǎng)法）：切成23cm3小塊靜沉去上清加新消化液37消化（2030分鐘）靜沉去上清加營(yíng)養(yǎng)液并吹打計(jì)數(shù)接種培養(yǎng)加培養(yǎng)液并吹打 第一步離心后：中和（BSS）離心 溫消化加胰蛋白酶37消化14小時(shí)濾過(guò)清洗靜沉去上清 離心去上清 冷消化加胰蛋白酶4消化624小時(shí)2. 傳代培養(yǎng)（1）（首次）傳代：使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過(guò)程。生長(zhǎng)密度不高不能急于接種。胰蛋白酶消化注意時(shí)間。吹打要輕巧。pH不能高，寧可偏低些。首次接種細(xì)胞數(shù)量要多些。（2）常規(guī)傳代：1）貼壁細(xì)胞：消化法 直接吹打法 刮除法 2）懸浮細(xì)胞：直接吹打法 自然沉降法（十二） 細(xì)胞檔案的建立以美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)，必須有以下的鑒定數(shù)據(jù)，才能入庫(kù)：組織起源和已經(jīng)傳代的代數(shù) 凍存液 細(xì)胞活力 培養(yǎng)液：培養(yǎng)基、血清和抗生素融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性 接種存活率 細(xì)胞形態(tài) 核型 無(wú)菌檢測(cè)：細(xì)菌、真菌等物種檢測(cè)：檢測(cè)同工酶譜 反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè) 細(xì)胞建立者 檢測(cè)者（十三） 單細(xì)胞分離培養(yǎng)常用培養(yǎng)技術(shù)：懸滴培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞的名稱：組織來(lái)源 人名 時(shí)間地點(diǎn) 臨床疾病類型培養(yǎng)細(xì)胞的純化：自然純化 人工純化 酶消化法 機(jī)械劃除法 反復(fù)貼壁法克隆法，培養(yǎng)基限定法，流式細(xì)胞分離法等將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)后讓細(xì)胞分散在底物上適應(yīng)性和活力好的細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞小群（克?。?. 單細(xì)胞分離培養(yǎng)：又稱為細(xì)胞克隆，即把一個(gè)單細(xì)胞從一個(gè)群體中分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成為一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。2. 細(xì)胞群中單個(gè)細(xì)胞形成的克隆的百分?jǐn)?shù)稱為克隆形成率或接種率，用來(lái)表示細(xì)胞生活力和獨(dú)立生長(zhǎng)能力。 100% 培養(yǎng)基表面形成的克隆數(shù) 測(cè)得的細(xì)胞總數(shù)3. 提高克隆形成率的措施：（1）培養(yǎng)基：最后使用適應(yīng)性培養(yǎng)基，即不含細(xì)胞而被細(xì)胞生活過(guò)的培養(yǎng)基。（2）利用飼養(yǎng)細(xì)胞：飼細(xì)胞即滋養(yǎng)細(xì)胞，一層經(jīng)過(guò)特殊處理的用做克隆細(xì)胞底物的細(xì)胞層。（3） 其他：血清、激素、CO2、底物特殊處理、適應(yīng)性底物、接種密度。4. 技術(shù)方法：（1）有限稀釋法：制備細(xì)胞懸液，密度為10個(gè)細(xì)胞/mL。 （2）毛細(xì)管法。 （3）將細(xì)胞接種在不同的接種底物上。底物適用多孔培養(yǎng)液?jiǎn)渭?xì)胞分離單層瓊脂雙層瓊脂飼細(xì)胞單細(xì)胞分離，克隆形成率軟瓊脂克隆形成率（轉(zhuǎn)化細(xì)胞）碟皿（聚苯乙烯或玻璃制）克隆形成率5. 細(xì)胞轉(zhuǎn)化：細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變的一種變化。 其性狀可以代代相傳，能夠長(zhǎng)期維持和存在。 分為一般轉(zhuǎn)化和惡性轉(zhuǎn)化。6. 細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化：沒(méi)有使用任何誘變劑處理下，細(xì)胞自發(fā)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。7. 人工誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化：利用化學(xué)、物理或生物的各種致癌物人為誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 誘變劑（致癌物）：（1）物理因素：放射線。（2）化學(xué)因素：亞硝胺類、多環(huán)芳烴、氯乙烯等。（3）生物因素：黃曲霉素、多發(fā)瘤病毒等。（4）促癌劑：十二癸豆蔻（TPA）（5）間接致癌物：需經(jīng)過(guò)酶活化才會(huì)形成終末致癌物。8. 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程：（1）誘發(fā)階段 （2）DNA的損傷與修復(fù)階段（3）“轉(zhuǎn)化灶”的產(chǎn)生。 人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的程序：低血清培養(yǎng)。9. 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法：（1）原代培養(yǎng)：取材腫瘤細(xì)胞集中、活力好的部分。防止污染（交叉）。及時(shí)去除成纖維細(xì)胞。 （2）傳代培養(yǎng)：不要急于傳代（長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面）。適當(dāng)提高接種密度。消除成纖維細(xì)胞。（十四） 動(dòng)物細(xì)胞藥物試驗(yàn)（5個(gè)等級(jí)、觀測(cè)指標(biāo)、測(cè)IC50&趨勢(shì)圖）1. 細(xì)胞培養(yǎng)的藥物試驗(yàn)（動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用）（1） 優(yōu)點(diǎn)：可以直接用人細(xì)胞作為測(cè)試對(duì)象。細(xì)胞的均一性好。獲結(jié)果迅速。 可結(jié)合多種技術(shù)方法測(cè)知藥物效應(yīng)。比動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)。（2） 注意事項(xiàng)：體內(nèi)和體外環(huán)境不同，藥物試驗(yàn)的結(jié)果可能有所偏差。 比較適用于單質(zhì)藥物的測(cè)試。 非水溶性藥物測(cè)試的溶劑，應(yīng)設(shè)溶劑對(duì)照組。2. 藥物劑量：先測(cè)出半效應(yīng)量IC50（梯度數(shù)值測(cè)試，常用MTT法測(cè)定），取作為主要測(cè)試劑量。3. 細(xì)胞生長(zhǎng)的5個(gè)等級(jí)：04度。 觀測(cè)指標(biāo)：（1）化學(xué)成份 （2）形態(tài)結(jié)構(gòu)（3） 生長(zhǎng)和增殖速率 （4）細(xì)胞死亡4. 細(xì)胞培養(yǎng)在癌癥研究中的應(yīng)用：（1）利用人工轉(zhuǎn)化研究癌變的原理。 （2）抗癌藥物的檢測(cè)。 （3）癌基因的研究。5. 藥物療效的評(píng)價(jià)：（1）體外抑瘤試驗(yàn)：IC5010g/mL。最高抑制效80%以上。 判斷：樣品對(duì)細(xì)胞有殺傷作用。 （2）體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)：瘤重抑制率=（1-）100% 中草藥抑制率大于30%，合成藥大于40% 療效為生命延長(zhǎng)率=（-1）100%5. 藥物敏感性試驗(yàn)：（1）美藍(lán)法：原理活細(xì)胞脫氫酶使甲烯藍(lán)還原為甲烯白。 死細(xì)胞藍(lán) （2）染料排斥試驗(yàn)法：原理活細(xì)胞在低濃度染液中不著色。 0.2%臺(tái)盼藍(lán)或0.1%的伊紅 （3）生長(zhǎng)曲線測(cè)定法：原理癌細(xì)胞可以呈指數(shù)生長(zhǎng)。加藥后藥物影響可通過(guò)生長(zhǎng)曲線反映。 可獲得三方面數(shù)據(jù)：藥物對(duì)增殖細(xì)胞的殺傷率=100% 藥物對(duì)倍增時(shí)間的影響：TD=t 藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度的影響：Ns= （4）集落形成試驗(yàn)法：集落抑制率=（1-）100%在半對(duì)數(shù)紙上以集落抑制百分率與劑量對(duì)數(shù)作圖可以得一條S形曲線并求出藥物的IC50值。 集落存活分?jǐn)?shù)= （計(jì)算IC50的方法之一） （5）四唑鹽（MTT）比色法：細(xì)胞存活率=100% （計(jì)算IC50的方法之二） （6）ATP生物發(fā)光法：ATP作用于熒光素?zé)晒馍匮趸浮?（計(jì)算IC50的方法之三） （7）放射性同位素?fù)饺敕?（8）抗癌藥的效能比測(cè)定法：藥物效能比=如果效能比=1，表示該藥物對(duì)細(xì)胞殺傷無(wú)選擇性。6. 裸鼠移植瘤試驗(yàn)理想的體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ停ǚ羌?xì)胞試驗(yàn)）：小鼠骨髓基質(zhì)集落形成細(xì)胞（CFU-F）療效評(píng)定以治療結(jié)束時(shí)給藥組瘤體積小于對(duì)照組50%或存活天數(shù)超過(guò)對(duì)照組的50%，才認(rèn)為有效。7. 不同的抗癌藥物的生物效應(yīng)指標(biāo)選擇：（1）生物化學(xué)成分 （2）形態(tài)結(jié)構(gòu) （3）生長(zhǎng)和增殖 （4）細(xì)胞死亡8. 癌基因的研究：轉(zhuǎn)染技術(shù)（磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體法、顯微注射法等）（十五） 動(dòng)物組織培養(yǎng)的進(jìn)展1. 無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)（1） 原因：血清干擾性（2） 應(yīng)用：生長(zhǎng)因子、單抗制備、分泌產(chǎn)物等 EGF：表皮生長(zhǎng)因子，促有絲分裂，改善表皮角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)。 FGF：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促有絲分裂，穩(wěn)定表型，延緩衰老。 IGF：生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，促進(jìn)運(yùn)輸，促肝細(xì)胞分裂，促雞胚細(xì)胞分化。 PDGF：血小板生長(zhǎng)因子。（3） 組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)液、輔加成分（4） 無(wú)血清培養(yǎng)的操作中注意問(wèn)題：成分活性 傳代頻率 接種密度經(jīng)常檢測(cè) 試劑純凈2. 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：常用的方法有三類：?jiǎn)螌屿o置貼壁培養(yǎng)法 懸浮培養(yǎng)法 固定化培養(yǎng)法3. 特種細(xì)胞組織培養(yǎng)（1） 表皮細(xì)胞的培養(yǎng)：切割消化分離真皮和表皮消化培養(yǎng)（2） 肝細(xì)胞：初代組織塊培養(yǎng) 初代消化法培養(yǎng)（3） 軟骨細(xì)胞：切碎軟骨組織透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶和膠原酶消化兩遍膠原酶長(zhǎng)時(shí)間收集F12培養(yǎng)液（4） 成骨細(xì)胞（5） 神經(jīng)原細(xì)胞：取新生大鼠腦，接種于聚L-賴氨酸覆底的培養(yǎng)皿內(nèi)4. 種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存（1） 細(xì)胞凍存：培養(yǎng)液+保護(hù)劑（甘油或二甲基亞砜） 要點(diǎn)：慢凍快融。 防護(hù)劑依細(xì)胞而定。（3） 細(xì)胞運(yùn)輸：液氮或干冰貯存運(yùn)輸。 充液法（十六） 大規(guī)模培養(yǎng)1. 大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的類型：（1）批量換液（分批培養(yǎng)） （2）半連續(xù)批量培養(yǎng)系統(tǒng) （3）連續(xù)灌注法 （4）連續(xù)-流動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)2. 大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的方法（1）單層靜置貼壁培養(yǎng)法1）優(yōu)點(diǎn)：易換液 易觀察 便于采用灌注技術(shù)培養(yǎng)液/細(xì)胞比例易改變 易適應(yīng)環(huán)境2）缺點(diǎn)：規(guī)模受限 取樣、計(jì)數(shù)困難 控制pH和O2困難 占空間 易污染3）方式：轉(zhuǎn)管及轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)圓柱管培養(yǎng)（2）固定化培養(yǎng)法：與單層貼壁不同、固定在一定空間內(nèi)1）優(yōu)點(diǎn)：易更換培養(yǎng)，易進(jìn)行灌注。細(xì)胞和培養(yǎng)液易分離。細(xì)胞密度大，易制備產(chǎn)品。2）缺點(diǎn)：難傳代和擴(kuò)大生產(chǎn)3）方式：多層培養(yǎng)法：原理提供大量的細(xì)胞生長(zhǎng)面積微載體培養(yǎng)法：原理載體攜帶細(xì)胞呈懸浮狀，增加細(xì)胞附著面積，使細(xì)胞與培養(yǎng)基充分接觸中空纖維培養(yǎng)法：原理采用合成的中空纖維制成類似脈管分布擴(kuò)散系統(tǒng)玻璃珠床反應(yīng)器：原理使細(xì)胞貼附在玻璃珠表面包埋細(xì)胞培養(yǎng)法：原理使細(xì)胞包埋在有孔微載體內(nèi)（3）懸浮培養(yǎng)1）優(yōu)點(diǎn)：可擴(kuò)大生產(chǎn) 與營(yíng)養(yǎng)充分接觸 條件穩(wěn)定均一 連續(xù)密閉系統(tǒng)可長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng) 細(xì)胞保持生物學(xué)特性2）細(xì)胞對(duì)懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)：懸浮培養(yǎng)對(duì)造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白血病細(xì)胞、類淋巴細(xì)胞是最適合的，但對(duì)貼壁細(xì)胞，需經(jīng)適應(yīng)。3）選擇法：懸浮貼壁再懸浮再貼壁 反復(fù)多次4）適應(yīng)法：懸