高效液相色譜定量分析過(guò)程可分為樣品的前處理

高效液相色譜定量分析過(guò)程可分為樣品的前處理、標(biāo)準(zhǔn)品的配制、進(jìn)樣、色譜分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理等七個(gè)步驟。 一 誤差的主要來(lái)源 隨著現(xiàn)在市場(chǎng)銷(xiāo)售儀器自動(dòng)化程度的提高，進(jìn)樣、色譜分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的誤差越來(lái)越小，尤其在高效液相色譜定量分析中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差可能主要來(lái)源于樣品的前處理及標(biāo)準(zhǔn)品的配制。 1、樣品的前處理 樣品的萃取率是樣品前處理時(shí)存在的主要問(wèn)題。當(dāng)固-液萃取（含柱分離的前處理方法），液-液萃取時(shí)，存在萃取率不高且不穩(wěn)定的問(wèn)題。尤其在除去蛋白質(zhì)時(shí)，存在變性蛋白質(zhì)會(huì)吸附一些被測(cè)組分，導(dǎo)致萃取率降低的情況。通常，萃取率是通過(guò)在式樣中添加被測(cè)成分在萃取的方法評(píng)價(jià)的。也就是說(shuō)，被測(cè)成分的增加量和液相色譜中的峰面增大成比例關(guān)系，通過(guò)這種方法可以確定溶液中被測(cè)成分的變化趨勢(shì)。 如果存在萃取率不穩(wěn)定的問(wèn)題，就有必要改變萃取的方法，要預(yù)先添加內(nèi)標(biāo)，然后萃取。這種情況采用的內(nèi)標(biāo)，必須與被測(cè)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，萃取的萃取率才可能相近。如果回收率不但接近100%而且較為穩(wěn)定，可以證明這種前處理方法較為可靠。在分析中如果能充分考慮以上誤差產(chǎn)生的各種原因，才有可能得到精確的分析結(jié)果。 2、標(biāo)準(zhǔn)品的配制 本帖中討論的問(wèn)題帶有普遍性，影響高效液相色譜分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多，僅在標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置過(guò)程中，可以分為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱(chēng)量，溶液的配制和溶液的儲(chǔ)存三個(gè)環(huán)節(jié)。 作為標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)其純度要求很高，應(yīng)避免使用純度不符合要求的試劑，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有不可替代性，現(xiàn)在市場(chǎng)有銷(xiāo)售的HPLC專(zhuān)用的溶劑及各種標(biāo)準(zhǔn)試劑可供實(shí)驗(yàn)選擇；其次選擇與樣品濃度要求相適應(yīng)的天平，應(yīng)該盡可能使用高精度的天平，這樣才能把由于天平使用帶來(lái)的稱(chēng)量操作誤差降至最低。 二 消除誤差的方法 要提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，必須考慮在分析過(guò)程中可能產(chǎn)生的各種誤差，采取有效措施，將這些誤差減到最小。 1、選擇合適的分析方法 各種分析方法的準(zhǔn)確度是不同的?；瘜W(xué)分析法對(duì)高含量組分的測(cè)定能獲得準(zhǔn)確和較滿(mǎn)意的結(jié)果，相對(duì)誤差一般在千分之幾。而對(duì)低含量組分的測(cè)定，化學(xué)分析法就達(dá)不到這個(gè)要求。儀器分析法雖然誤差較大，但是由于靈敏度高，可以測(cè)出低含量組分。在選擇分析方法時(shí)，一定要根據(jù)組分含量及對(duì)準(zhǔn)確度的要求，在可能條件下選最佳分析方法。 2、增加平行測(cè)定的次數(shù) 如前所述增加測(cè)定次數(shù)可以減少隨機(jī)誤差。在一般分析工作中，測(cè)定次數(shù)為24次。如果沒(méi)有意外誤差發(fā)生，基本上可以得到比較準(zhǔn)確的分析結(jié)果。 3、消除測(cè)定中的系統(tǒng)誤差 消除測(cè)定中系統(tǒng)誤差可采取以下措施：其一是做空白實(shí)驗(yàn)，即在不加試樣的情況下，按試樣分析規(guī)程在同樣操作條件下進(jìn)行的分析。所得結(jié)果的數(shù)值稱(chēng)為空白值。然后從試樣結(jié)果中扣除空白值就得到比較可靠的分析結(jié)果。其二是注意儀器校正，具有準(zhǔn)確體積的和質(zhì)量的儀器，如滴定管、移液管、容量瓶和分析天平，都應(yīng)進(jìn)行校正，以消除儀器不準(zhǔn)所引起的系統(tǒng)誤差。因?yàn)檫@些測(cè)量數(shù)據(jù)都是參加分析結(jié)果計(jì)算的。其三是作對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)照試驗(yàn)就是用同樣的分析方法在同樣的條件下，用標(biāo)樣代替試樣進(jìn)行的平行測(cè)定。將對(duì)照試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)樣的已知含量相比，其比值稱(chēng)為校正系數(shù)。 校正系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)試樣組分的標(biāo)準(zhǔn)含量/標(biāo)準(zhǔn)試樣測(cè)定的含量 被測(cè)試樣的組分含量=測(cè)得含量校正系數(shù) 綜上所述，在分析過(guò)程中檢查有無(wú)系統(tǒng)誤差存在，作對(duì)照試驗(yàn)是最有效的辦法。通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)可以校正測(cè)試結(jié)果，消除系統(tǒng)誤差。 4、樣品定量分析過(guò)程中的誤差 樣品處理要盡量減少操作者的技術(shù)問(wèn)題帶來(lái)的誤差，樣品的稀釋次數(shù)、稀釋工具都是誤差的禍根，應(yīng)盡量減少稀釋次數(shù)，稀釋工具用高準(zhǔn)確度的。樣品中的干擾組分會(huì)直接影響分析的準(zhǔn)確度，而且有些組分會(huì)損壞柱子。純化樣品的過(guò)程盡量少用蒸發(fā)至干的步驟（在色譜分析中這一步又是不可少的），正確操作固相柱萃取、純化小柱使用的步驟，注意提高每一步的回收率，使用內(nèi)標(biāo)法也是一個(gè)能準(zhǔn)確定量的方法。 在手動(dòng)進(jìn)樣中進(jìn)樣體積至少是樣品定量環(huán)管體積的3倍，色譜分離程序要使色譜峰的分離度大于1.5，控制流動(dòng)相、流量、溫度等的平穩(wěn)。流動(dòng)相的污染都會(huì)抬高基線(xiàn)或減少信噪比，分辨率下降，試驗(yàn)條件的變化，如柱退化、不好的流動(dòng)相等都能引起保留時(shí)間變化，引起一個(gè)峰或更多的峰不能被鑒別。正確設(shè)定儀器參數(shù)，選用合理的數(shù)據(jù)處理參數(shù)，用峰面積計(jì)算結(jié)果比峰高更精確