生物學實驗室儀器的應用與實驗技術.ppt

生物學實驗室儀器的應用與實驗技術theapplicationsandtechniquesofexperimentalequipmentsinbiology 張學琴生命科學大樓4027室tel 62732654 62734837email zhangxq711 1 本課程主要介紹生物學實驗所用的常用儀器及其在生物研究中的應用 主要包括 離心技術 超速和高速 光譜技術 紫外 原子 熒光 基因芯片技術顯微技術 confocal etc 定量pcr技術蛋白質組學液質聯(lián)儀 參考書 1 周先碗胡曉倩編生物化學儀器分析與實驗技術化學工業(yè)出版社 第三版 2 王立汪正范牟世芬丁曉靜編著色譜分析樣品處理化學工業(yè)出版社3 師治賢王俊德編著生物大分子的液相色譜分離和制備科學出版社 第二版 4 5 結課方式 考試 50 課程論文 50 一 離心技術二 離心機的種類三 離心機和轉頭的維護四 離心機的事故五 離心技術在樣品制備中的作用 第一章離心技術 1 離心機發(fā)展歷史2 基本概念3 離心分離方法 一 離心技術 19世紀手搖離心機蜂蜜 牛奶20世紀超速離心機生物學 醫(yī)學 制藥工業(yè)等廣泛應用 1 離心機發(fā)展歷史 1923年瑞典化學家svedberg第一臺具有光學系統(tǒng)的分析超速離心機 最高轉速達45 000rpm 1926年svedberg測定馬血紅蛋白分子量 首次證明蛋白質為均一的生物大分子 1940年svedberg和同事pederson撰寫世界上第一本有關離心技術的專著 超速離心技術發(fā)展階段 1951年brakkemk在差速離心的基礎上發(fā)展了速率區(qū)帶離心法 1955年andersonng發(fā)明了區(qū)帶轉頭 并用區(qū)帶離心法首次證明dna雙螺旋結構半保留復制的假說 離心機制造工藝 區(qū)帶轉頭 高強度的鈦合金的應用 半導體集成電路 計算機技術的發(fā)展 高頻調速電機的使用 1 基本概念 1 離心技術 centrifugetechnique 利用物質在離心力作用下 按其沉降系數(shù)不同而分離的一種技術 gt g為重力加速度 980cm s2 物體在沉降過程中 其下沉的力在某個時刻總會與摩擦力 浮力達到平衡 使物體的受力為零 此時物體在做勻速運動 此時的速度稱為臨界速度 一個球型顆粒在具有重力場中的液體介質內 受到地球引力 溶液浮力和溶液黏滯力的作用 出現(xiàn)不同的運動 粘滯力和浮力向上 重力向下 重力fg 1 6 d3 pg d為顆粒直徑 為顆粒密度 g為重力加速度 3 顆粒在重力場的運動 粘滯力ff 3 dv v為顆粒沉降速度 浮力fb 1 6 d3 mg m為介質密度 當作用在顆粒上的總力為零時 顆粒做勻速運動 即達到臨界速度 作用力的關系式為 fg fb ff v d2 p m g 18 a 與顆粒直徑d2的大小成正比 顆粒大沉降快 b 與顆粒和介質密度差 p m 成正比 密度之差越大 沉降越快 c 當 p m 顆粒沉降速度為正值 即顆粒在介質中往下沉 等于 做不定向運動 小于 顆粒在介質中上浮 v d2 p m g 18 d 與引力g成正比 速度隨著引力的增加而增加 e 與介質粘度 成反比 速度隨粘度的增加而降低 4 顆粒在離心場中的沉降 5種力 離心力 向心力 重力 浮力 介質摩擦力 從理論上講 只要顆粒的比重大于液體就會發(fā)生沉降 但是對于分離生物材料的樣品 如細胞 細胞器 細菌 病毒 蛋白質和核酸等生物大分子來說 由于顆粒非常細小 依靠自然沉降是不能達到完全分離的 只能通過離心力的作用才能使它們沉降下來 離心力的產生 離心場的受力 g 2r 物體在圍繞轉軸以角速度旋轉時 就產生離心場 物體在離心場中受到離心力的作用 電機的速度以每分鐘的轉數(shù) r min 表示 g 2r 4 2n2r 3600 n為每分鐘的轉數(shù) 單位為r min g的單位是cm s2 正好與重力加速度g的單位一致 在實踐中 離心力可用重力加速度的倍數(shù)g g來表示 稱之為相對離心力 用rcf表示 可將公式寫成 rcf g g 4 2n2r 3600 980 1 12 10 5n2rn 1000 rcf 11 2r 1 2 相對離心力 rcf 因此 超速離心常用重力加速度的倍數(shù) g 來代替轉速 r min 真正反映顆粒在離心管中所受到的離心力 一般 低速離心 轉速以r min表示 高速離心 轉速以重力加速度g表示 計算顆粒相對離心力時 應注意離心管與中心軸間的距離 即離心半徑r的長度 離心管所處的位置不同 沉降顆粒所承受的離心力也不同 沉降系數(shù) sedimentationcoefficient s 沉降系數(shù)是生物大分子的特征常數(shù) 與顆粒密度 形狀 大小 與介質密度 粘度 與溫度 濃度都有關系 20 以水為介質的條件下 測得s值為標準狀態(tài)下的s值 1s 10 13秒 k因子 表示沉降系數(shù)為s的顆粒 在轉頭的最大速度下離心時 顆粒從小半徑沉降到大半徑所需要的時間 t k s表示從離心管表面沉降到離心管底所需要的時間 k是轉頭的實際參數(shù) 沉降與相關因素 t 1013 3600 lnrb lnrm 2srb 軸與離心管間距離rm 軸與管液面間距離 3 離心分離方法 沉淀離心差速離心速率區(qū)帶離心等密度離心淘洗離心連續(xù)流離心 1 沉淀離心常用方法 指介質密度約1g ml 選用一種離心速度 使懸浮液中的懸浮顆粒在離心的作用下完全沉淀下來 這種離心方式稱沉淀離心 沉降速度與離心力和顆粒大小有關 顆粒沉降離心中的兩個因素 相對離心力 g 和時間 min 沉降某顆粒需10 000g min 凡是利用顆粒在離心場中的沉降系數(shù)差異進行逐級分離的離心方法 稱差速離心 差速離心是建立在顆粒的大小 密度和形狀有明顯的不同 沉降存在較大的差異的基礎上進行分離的方法 一般用于粗級分離 而不用于精細分離 2 差速分級離心 3 密度梯度離心凡使用密度梯度介質離心的方法稱這密度梯度離心或稱區(qū)帶離心 分辨率比差速離心高 差速離心沉降系數(shù)相差10倍以上 密度梯度離心沉降系數(shù)相差10 20 s的顆粒或顆?；蛎芏炔钚∮? 01g ml的組分 兩種類型 速率區(qū)帶離心 因顆粒的不同沉降速度而分層 可分離與密度介質相當?shù)募毎?細胞器 dna和蛋白質 分離效果只與分離物質的的大小有關 與介質的密度無關 等密度區(qū)帶離心 因顆粒的不同密度而分層 在等密度介質中的密度范圍正好包括所有分離顆粒的密度 樣品可以加在制成的梯度介質的上面 也可以與密度介質混合在一起 離心后會形成自成型梯度 顆粒在等密度梯度的介質中 經過離心 最終將停留在與其浮力密度相等的區(qū)域內 形成一個區(qū)帶 顆粒密度和介質密度達到平衡時 所形成的顆粒區(qū)帶就停止運動 延長離心時間對離心效果無明顯影響 即此時與離心時間無關 密度梯度離心的制備 密度梯度溶液 不均一 密度隨著旋轉半徑的增加而增加 e g 5 1 018g ml 20 1 077g ml 蔗糖為梯度液 密度梯度材料 氯化鋰 氯化銫 氯化銣 酒石酸鉀 甘油 蔗糖和聚蔗糖等 不能與樣品發(fā)生化學反應ph 滲透壓不能影響所用的測量技術 e g 蛋白質 280nm不能對轉頭有腐蝕 預成型梯度 線性梯度 不連續(xù)的階梯梯度 指數(shù)梯度自成型梯度 不連續(xù)梯度通過手工制作梯度界面不能破壞連續(xù)梯度 梯度混合器 用注射器將樣液加在梯度液上面樣品體積和濃度適量注意 離心管內的梯度液可承受的樣品的最大濃度為該密度梯度液中最低密度梯度濃度的1 10 等密度加樣 樣液加在密度介質的上面或與密度介質混合在一起 不要污染樣品不要破壞梯度的穩(wěn)定性在操作過程中不能使氣泡進入梯度中 手工回收 二 離心機的種類 1 按離心機的速度 1 低速離心機最大轉速 vmax 一般在6000r min 2 高速離心機vmax 25000r min 3 超速離心機vmax 100000r min 一 分類 2 按離心機的用途 1 小型離心機小量快速離心 2 制備型大容量低速離心機vmax 6000r min 最大離心力6000 g 最大容量達500ml 6 3 高速冷凍離心機vmax 18000 21000r min 最大離心力在50000 g 適用于細胞和亞細胞的分離 4 超速離心機最大離心力可達800000 g 可進行小量制備 適用于蛋白質 核酸和多糖等生物大分子的制備 5 分析型離心機用于生物大分子定性 定量分析 6 連續(xù)流離心機處理類似于發(fā)酵液等特大體積 濃度較稀的樣品 最大離心速度與高速離心機相似 3 按離心機的驅動系統(tǒng) 1 空氣驅動離心機 2 油渦輪驅動離心機 3 電刷電機驅動離心機 4 變頻電機驅動離心機 二 基本結構 真空系統(tǒng) 1 分類角轉頭適用于差速離心 等密度離心 容量大 轉頭內容納的離心管多 水平轉頭離心管組裝在轉頭的吊桶內 離心機靜止狀態(tài)時離心管為垂直狀態(tài) 離心時離心管與軸垂直 適合于區(qū)帶離心和等密度離心 垂直轉頭適合于質粒dna的純化 不適合于差速離心 近垂直轉頭對質粒dna和rna的分離純化特別有效 區(qū)帶轉頭連續(xù)流轉頭 1 轉頭 2 性能鋁合金轉頭適合于ph6 8的中性溶液離心用中性溶液洗滌強度不高 易加工 易碰傷 高濃度鹽長期接觸會產生內結晶 影響轉頭的強度 溫度不得超過60 更不能用高溫滅菌處理價格便宜 使用壽命短 不銹鋼轉頭耐腐蝕 對酸 堿 鹽溶液均適宜 機械強度高 加工難 質量大 離心速度不高 使用壽命長 價格較便宜 鈦合金轉頭耐腐蝕 對酸 堿 ph3 5 11 溶液均適宜 機械強度高 加工難 質量較大 離心速度高 使用壽命長 價格較貴 碳素轉頭質量輕 有利于提速 耐腐蝕 在偏酸性或偏堿性的溶液中均可使用 機械強度高 加工容易 使用壽命長 價格昂貴 3 轉頭的主要參數(shù)最大轉速轉頭的抗拉強度是有限的 與轉頭的類型 構造和材料有關最大離心力最大容量每個轉頭中容納離心管數(shù)乘以離心管的最大體積就是該轉頭的最大容量 k因子在最大的轉頭速度下 由最小半徑沉降到最大半徑所需要的時間 k越小 離心能力越大 三 離心機和轉頭 beckmanle 80k optimal系列 轉頭 sw28sw55ti90 超速離心機 植物生理學與生物化學國家重點實驗室儀器室離心機有的關配置 落地式超速離心機2臺臺式超速離心機1 1臺落地式高速冷凍離心機2臺臺式高速冷凍離心機1臺 超速轉頭 rotors 配置 sw2828 000rpm14 1000g sw5555 000rpm368 000g ti9090 000rpm695 000g 臺式超速離心機 高速離心機 r22a222 000rpm51 200g50ml 6 300ml r12a312 000rpm23 800g300ml 6 1 800ml r10s10 000rpm16 470g50ml 4 200ml 三 離心機和轉頭的維護 1 離心機安全操作 不過速運轉平衡運轉準確組裝轉頭不使用帶傷轉頭不使用過期轉頭 2 離心機的維護每次用畢 對于超速離心機 只需定期清潔離心機內腔 對于高速離心機 每次必須將內腔擦干 且不能長期將轉頭置于轉軸上 以免傳感器受潮失靈 3 轉頭的維護離心機轉頭 如果忽視其設置的精密程度和嚴格的使用方法 就會大大影響它的奉命 事實上 一個轉頭在承受一百萬倍的大氣壓下 一克就相當于一噸的重量 若轉頭的表面有很細微的裂縫 對轉頭就會造成很大的影響 此影響可能會超過轉頭原本設置所能承受的范圍 1 維護轉頭壽命的三個因素 專門的設計和制造使用中的注意事項和合理的操作當損壞或因疲勞連續(xù)使用而產生不安全時 轉頭必須停用 轉頭的設計與制造一般的生產廠家 在制造轉頭時 會進行轉頭 馬達系統(tǒng)的震動測試 它們會在一個特殊構造的房間里進行非破壞性和破壞性試驗 來檢驗轉頭的壽命 引起離心機轉頭損壞的原因金屬疲勞化學腐蝕應力腐蝕 金屬疲勞轉子在加速過程中 材料內部多次重復受到拉伸或松馳的交變引力的作用 引起材料結構細微變化 經過一定次數(shù)的交變引力循環(huán) 這些細微變化導致極細微的裂紋 化學腐蝕由于所用的離心管不能承受介質的性質 或者離心管存放太久 老化后受不了強離心力的緣故 會造成離心管的破裂 樣品滲漏到轉頭內 若沒按規(guī)定程序操作 造成轉頭不密封 當抽真空時 轉頭內腔產生負壓 也會樣品滲漏 對轉頭產生化學腐蝕而嚴重影響轉頭的壽命 應力腐蝕應力腐蝕是金屬疲勞和化學腐蝕兩者同時作用產生的結果 當轉頭某部分因受化學腐蝕或破損后 該部分所承受的引力增大了 此種情況下 轉頭便會很容易毀壞 2 轉頭操作的注意事項避免cscl結晶cscl溫度過低產生結晶 沉降就會脹破離心管 從而損壞轉頭 轉頭需加蓋由于疏忽大意 勿將轉頭蓋蓋緊 或忘記加蓋 當轉頭運行時 離心腔內會產生空氣旋渦使轉頭浮起 轉頭離開轉軸而發(fā)生意外 因此在儀器啟動時 應再檢查轉頭蓋是否已蓋緊 注意溶液密度對轉頭速度的限額溶液密度大小對轉頭強度受力有很大關系 在進行密度梯度或等密度離心時 配置的介質密度必須低于說明書中標記的轉頭所能承受的最大密度 若高于該密度 可用下列公式計算最大速度 當采用塑料管戴硬鋁帽 樣品比重大于1 2 新的最大速度 轉子最大轉速 1 2 新的密度 1 2當采用不銹鋼管戴硬鋁帽 樣品比重小于1 2 最大允許轉速必須減少設定速度的15 即最大允許速度 最大設定轉速 1 15 當采用不銹鋼管及管帽 樣品比重小于1 2時 最大設定轉速必須減少25 3 轉頭的保養(yǎng)轉頭的清潔所有的轉頭使用后必須用溫水洗滌并干燥 如果必須使用去污劑 則不應使用堿性去污劑 轉頭干燥 涂油保養(yǎng)嚴禁將轉頭浸泡在去污劑中 沖凈后的轉頭必須干燥 通常在室溫下將轉頭倒置自然干燥 轉頭外表可稍涂些硅脂保護表面 轉頭內壁腔可涂上硅油保護 密封圈轉頭蓋與吊桶內壁的密封圈可使轉頭和離心管在密封的情況下運行 如果密封圈老化 轉頭內便因離心腔抽真空而形負壓 使離心管破裂或滲漏損壞轉頭 因此 密封圈如有損壞 應及時更換 更換前應涂上真空脂 加強保護 超速盤的更換為了保證轉子的正常運行 使用前必須檢測超速盤有否磨損 轉子使用后 將轉子清洗倒放在實驗桌上 當發(fā)現(xiàn)轉子底部的超速盤損壞或磨損 必須立即更換 首先將損壞的超速盤取下 然后用四氯化碳有機溶劑清洗干凈 再將備用的超速盤換上 轉頭壽命的折算一般是最大轉速的次數(shù) 若轉頭動作已超過其壽命保證期 在沒有任何損傷的情況下 轉頭應按90 折算后再繼續(xù)使用 四 離心機的事故 正在旋轉 后果 五 離心技術在樣品制備中的作用 分離活體生物 細胞 微生物 病毒細胞器 細胞核 細胞膜 線粒體生物大分子 核酸 蛋白質 酶 多聚物 植物細胞膜