羥基磷灰石納米粒子體外抗肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.doc

此文檔收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除羥基磷灰石納米粒子體外抗肝癌的實(shí)驗(yàn)研究 肝癌嚴(yán)重危害人類的健康，目前大多數(shù)化療藥物療效雖然快但不理想，而且副作用大，因此，臨床應(yīng)用受到限制。羥基磷灰石（HAP）納米粒子具有良好的生物相容性、生物活性、化學(xué)穩(wěn)定性及廣譜抑癌作用13，但對正常細(xì)胞的影響研究較少。我們的實(shí)驗(yàn)旨在研究HAP納米粒子對肝癌細(xì)胞及肝細(xì)胞的選擇性作用，探討應(yīng)用于肝癌臨床治療的可能性。1材料和方法1.1試劑及儀器 DMEM(Gibco)；新生牛血清(Gibco)；型膠原酶(Gibco)。倒置顯微鏡(CK_40 Olympus, Japan)；酶標(biāo)檢測儀(MB _，北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所)；粒徑分析儀(Zataplus，Brookhaven)；透射電鏡(H_600 Hitachi, Japan)。1.2細(xì)胞株及動物細(xì)胞系Bel_7402人肝癌細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫，由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。Wistar大鼠，雄性，SPF級，體重260g300g，由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心供給，合格證號：19084。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1HAP納米粒子制備與檢測以Ca(OH)2飽和液和Ca(H2PO4)2為原料，應(yīng)用均相沉淀法制備HAP納米粒子。高壓滅菌，臨用前用DMEM培養(yǎng)液稀釋，終濃度為1.4104mol/L、1.4105mol/L、1.4106mol/L三組。常規(guī)制備透射電鏡(TEM)標(biāo)本，鏡下觀察HAP納米粒子形狀、大小及分散狀態(tài)。1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞分4組：C、C1、C2、C3，其中C為空白對照組，C1C3分別含有1.4104mol/L、1.4105mol/L、1.4106mol/L HAP納米粒子組。肝細(xì)胞分組同上，與其對應(yīng)的為N、N1、N2、N3。對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞經(jīng)0.25胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)基(含10小牛血清、10萬U/ml青霉素、10萬g/ml鏈霉素)配成單細(xì)胞懸液，以2104個細(xì)胞/ml接種于25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，計(jì)40瓶。肝細(xì)胞的分離依據(jù)文獻(xiàn)4進(jìn)行，以上述同樣方法配制肝細(xì)胞懸液，接種40瓶。將全部培養(yǎng)瓶置37、5CO2下培養(yǎng)，24小時后更換培養(yǎng)液，給藥組換含不同濃度HAP納米粒子的培養(yǎng)液，對照組加等量新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5天，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.3形態(tài)學(xué)觀察及活細(xì)胞計(jì)數(shù)在培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)學(xué)改變。每天每組取2瓶，經(jīng)0.25的胰酶消化后，取30l細(xì)胞懸液加2臺盼藍(lán)染液混勻，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，每瓶計(jì)數(shù)3次，取其平均值，拒染細(xì)胞為活細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果行t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1HAP納米粒子的大小、形態(tài)透射電鏡下觀察HAP納米粒子呈均勻分散的針狀顆粒，平均粒徑67.6nm，粒徑分析儀測定有效平均粒徑為72.3nm。2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化培養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，肝癌細(xì)胞呈典型的多邊形貼壁生長。培養(yǎng)5天連續(xù)觀察到C組Bel_7402細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，第4天達(dá)高峰(見圖1)。用HAP納米粒子處理的C1組，24小時內(nèi)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量沒有明顯變化，隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，部分細(xì)胞變成圓形、梭形或不規(guī)則形，于第4天細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成大量空泡(見圖2)，多形性更加明顯。C2組、C3組與C組比較沒有明顯差異。新鮮分離的肝細(xì)胞呈單個分散狀態(tài)，為具有立體感的圓球形，晶瑩透亮，體積上大小一致。培養(yǎng)24小時后細(xì)胞單層鋪展，圓形或多邊形。N組細(xì)胞數(shù)始終呈上升趨勢；N1、N2、N3組未見細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量的顯著變化。2.3HAP納米粒子對細(xì)胞生長的影響高濃度的HAP納米粒子與2104細(xì)胞/ml共同孵育后，肝癌細(xì)胞的生長受到抑制，與對照組相比P0.01，且該作用隨HAP納米粒子作用時間的延長而增強(qiáng)。而對正常肝細(xì)胞的抑制作用較弱。如圖3所示。3討論原發(fā)性肝細(xì)胞癌是常見的惡性腫瘤，涉及細(xì)胞生長、分化與凋亡之間的調(diào)控失衡，以及環(huán)境與機(jī)體的相互作用5。肝癌的發(fā)病率高，而且還具有極強(qiáng)的臨床侵襲性，預(yù)后極差。許多抗肝癌的化學(xué)藥物通過不同的機(jī)制作用于肝癌細(xì)胞，但其療效不佳，相互之間可產(chǎn)生交叉耐藥性，并增加毒副作用。無機(jī)納米粒子在抗腫瘤方面初步顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢。納米粒子通常是指尺度在1nm100nm之間的微粒，由于其具有大的比表面積，表面原子數(shù)、表面能和表面張力隨粒徑的下降急劇增加，表現(xiàn)出了小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)及很強(qiáng)的吸附性和生物活性。納米粒子的抗腫瘤效應(yīng)分為兩類：其一，納米粒子藥物復(fù)合物，納米粒子在其中承擔(dān)載體的作用6;其二，單純納米粒子，主要發(fā)揮納米粒子本身的抗腫瘤效應(yīng)。我們研制的HAP納米粒子，平均粒徑67.6nm，利用其本身獨(dú)特的生物活性進(jìn)行了初步體外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)1.4104mol/L的HAP納米粒子有明顯的抗肝癌作用，與對照組相比差異顯著，相同濃度的HAP納米粒子作用于大鼠肝細(xì)胞，與對照組比較未見明顯抑制作用，即對肝細(xì)胞影響較小。提示HAP納米粒子具有體外抗肝癌效應(yīng)，且副作用較小?？赏ㄟ^進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)，深入研究HAP納米粒子的抗癌機(jī)理，為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1Li SP,Zhang SC,Chen WJ，et al.Effects of hydroxyapatite ultrafine powder or colony formation and cytoskeletones of MGc80_3 cellJ.Bioceramics,1998，9225227.2Feng LY,Li SP, Yan YH, et al.Inhibition of HAP nanopartics on W_256 sarcoma of rats in vivoJ.Chin Biomed Engin,2001,302304.3李世普，馮凌云，曹獻(xiàn)英，等.無機(jī)納米粒子抑制癌細(xì)胞的機(jī)理J.稀有金屬材料與工程, 2001,30(增刊)702705.4曹獻(xiàn)英，閆玉華，楊美娟，等. 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)的技術(shù)改良