植物DNA提取及檢測(cè)ppt課件.ppt

植物總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 植物基因組DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)提取和純化高等植物總DNA的方法 理解其原理 脫氧核糖核酸 DNA 核糖核酸 RNA 與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白 DNP 的形式存在 在制備核酸時(shí)通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來(lái)使核蛋白釋放出來(lái) 植物總DNA包括細(xì)胞核DNA和細(xì)胞核外DNA 前者存在于細(xì)胞核內(nèi) 后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi) 例如線粒體DNA mtDNA 和葉綠體DNA ctDNA 二 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸 基本過(guò)程 機(jī)械方法 超聲波處理法 研磨法 勻漿法 化學(xué)試劑法 用SDS處理細(xì)胞 酶解法 加入溶菌酶或蝸牛酶 破壞細(xì)胞壁 細(xì)胞破碎 SDS法SDS是有效的陰離子去垢劑 細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合 SDS能夠破壞這種價(jià)鍵 CTAB法CTAB是一種陽(yáng)離子去垢劑 它可以溶解膜與脂膜 使細(xì)胞中的DNA 蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來(lái) 并使蛋白質(zhì)變性 使DNA與蛋白質(zhì)分離 DNA提取 蛋白質(zhì)常用苯酚 氯仿 異戊醇 25 24 1 或氯仿 異戊醇 24 1 抽提 RNA常選用RNase消化 或是用LiCl來(lái)消除大分子的RNA 酚類物質(zhì)提取液中加少量巰基乙醇 選取幼嫩的材料 DNA純化 去雜質(zhì) 實(shí)驗(yàn)材料植物葉片 去葉脈 試劑2 CTAB抽提液 CTAB Tris HCL EDTA Nacl TE緩沖液 pH 8 0 氯仿 異戊醇 24 1 巰基乙醇異丙醇70 乙醇 三 材料與試劑 離心機(jī) 水浴鍋 研缽 微量移液器 儀器用具 移液器 量程的選擇 1 取2g清洗涼干的植物幼嫩葉片于研缽中 加入液氮 迅速研磨 將2 CTAB抽提液與2ml巰基乙醇在提取前混合后于65 水浴中加熱30分鐘 2 將0 5mL研磨液轉(zhuǎn)入1 5mL離心管中 加入1mlCTAB提取液 置于65 水浴中保溫30min 其間顛倒混勻2 3次 破碎細(xì)胞3 加入等體積氯仿 異戊醇 24 1 混合液 充分顛倒混勻20分鐘 防止成團(tuán) 8000r min 離心5min 取上清 抽提去蛋白4 將上清液移入新的1 5mL離心管內(nèi) 加等體積異丙醇 預(yù)冷 顛倒混勻 可見(jiàn)DNA絮狀沉淀 沉淀核酸5 8000r min 離心1min 倒掉上清液 將離心管倒置干燥 將沉淀回溶于無(wú)菌水或TE緩沖液待測(cè) 四 操作步驟 1 選取新鮮材料 研磨迅速?gòu)氐?研磨好的材料應(yīng)與CTAB抽提液充分混勻 2 若提取產(chǎn)物有顏色 可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì) 添加巰基乙醇 2 5 盡可能選取幼嫩的材料 3 收集CTAB與核酸形成的復(fù)合物時(shí)不要離心過(guò)度 否則沉淀再溶解難 4 為了獲得具有生物活性的天然核酸 在分離制備過(guò)程中必須采用溫和的條件 避免過(guò)酸過(guò)堿 劇烈地?cái)嚢?防止熱變性 同時(shí)還要避免核酸降解酶類的降解 五 注意事項(xiàng) 六 作業(yè) 為了獲得高質(zhì)量的植物總DNA 在分離提取過(guò)程中應(yīng)注意那些問(wèn)題 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù) DNA分子在高于等電點(diǎn)的PH溶液中帶負(fù)電荷 在電場(chǎng)中向正極移動(dòng) 在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下 DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比 二 實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物 濃度越高 孔隙越小 其分辨能力就越強(qiáng) 三 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等 Tris 硼酸 TBE Tris 乙酸 TAE Tris 磷酸 TPE 常用電泳緩沖液 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色 一般與蔗糖 甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液 作用 增加樣品比重 以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi) 形成肉眼可見(jiàn)的指示帶 預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置 使樣品呈色 使加樣操作更方便 上樣緩沖液 溴化乙錠 EB 是一種熒光染料 EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間 在紫外線激發(fā)下 發(fā)出紅色熒光 其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比 據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度 瓊脂糖凝膠EB染色 肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶 其DNA量一般 5ng EB是致癌物質(zhì) 切勿用手接觸 更不要污染環(huán)境 GoldViewTM 是一種可代替溴化乙錠 EB 的新型核酸染料 采用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA時(shí) GoldViewTM與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào) 其靈敏度與EB相當(dāng) 使用方法與之完全相同 在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光 而單鏈DNA呈紅色熒光 GoldView不僅能染DNA 也可用于染RNA 核酸染色劑 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 不同種類DNAMarker 1 凝膠制備制備1 瓊脂糖凝膠 稱取0 8g瓊脂糖加入80mL1 TAE 加熱至瓊脂糖全部熔化 冷卻至50 60 時(shí) 加入EB或GoldViewTM10ul 緩慢倒入膠板 待膠凝固后拔出梳子 2 加樣取15 lDNA樣液與2 l上樣buffeer混勻 用微量移液器小心加入樣品槽 3