放線菌的形態(tài)觀察.doc

. 【實驗題目】 放線菌的形態(tài)觀察【實驗?zāi)康摹?、 掌握放線菌觀察方法插片法2、 了解放線菌的基本形態(tài)【實驗器材】1、菌種：青色鏈霉菌、弗氏鏈霉菌2、培養(yǎng)基：滅菌的高氏號瓊脂培養(yǎng)基3、儀器和用具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、培養(yǎng)皿等【實驗原理】 1高氏I號培養(yǎng)基 高氏I號培養(yǎng)基是用來培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。此合成培養(yǎng)基的主要特點是含有多種化學(xué)成分已知的無機(jī)鹽，這些無機(jī)鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。因此，在混合培養(yǎng)基成分時，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時還需要將二種或多種成分分別滅菌，使用時再按比例混合。此外，合成培養(yǎng)基有的還要補(bǔ)加微量元素，如高氏I號培養(yǎng)基中，需要加入FeSO4。 2放線菌 放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細(xì)菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長的叫基內(nèi)菌絲，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲，并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。有的放線菌只產(chǎn)生基內(nèi)菌絲而無氣生菌絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣生菌絲在上層、基內(nèi)菌絲在下層，且氣生菌絲較暗，基內(nèi)菌絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。在油鏡下觀察，放線菌的孢子有球形、橢圓、桿狀或柱狀。能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)特征是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。 圖1：鏈霉菌一般形態(tài)和構(gòu)造（模式圖）1-直形，交叉分枝 2-叢生，波曲 3-頂端形成大螺旋 4-松螺旋 5,6-緊螺旋 7-短而直，輪生 圖2：鏈霉菌屬孢子絲的主要類型3插片法 將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征，而且便于觀察不同生長期的形態(tài)。圖3 1-蓋玻片2-瓊脂層 【實驗內(nèi)容及步驟】1、高氏I號培養(yǎng)基的制備（100ml）1)根據(jù)配方按照一定比例稱取可溶性溶粉、及其他成分溶解。2)待將所有藥品溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積，進(jìn)行pH調(diào)節(jié)到7.27.43)材料滅菌：將所配溶液裝在三角燒瓶中并加棉塞，棉塞外包一層牛皮紙，并用麻繩捆好，用記號筆標(biāo)記組號。取4個平皿，包好并標(biāo)記。同理蓋玻片也用牛皮紙包好，10片一包，準(zhǔn)備4包。將上述物品放入密封的加壓滅菌鍋中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌121、20分鐘。2、插片法進(jìn)行鏈霉菌的觀察1)倒平板：取融化并冷至大約50的高氏I號培養(yǎng)基分裝到4個培養(yǎng)皿中，倒平板時盡量使培養(yǎng)基厚一些，凝固待用。（可用記號筆在培養(yǎng)基底部畫好方向）2)接種：待培養(yǎng)基冷卻凝固后，無菌操作，用接種環(huán)挑取菌種在平板上密集劃線接種。（沿著之前用記號筆標(biāo)注的方向進(jìn)行劃線接種）3)插片：以無菌操作用鑷子將滅菌的蓋玻片以大約與培養(yǎng)基成45角插入平板內(nèi)，并與劃線垂直（即與記號筆標(biāo)注的方向垂直），每個平板至少插入3個蓋玻片。4)培養(yǎng)：將平板倒置，28下培養(yǎng)7天。5)鏡檢：用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，將無菌面朝上放在載玻片上，直接鏡檢。觀察時，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察，必要時可用油鏡觀察?！緦嶒灲Y(jié)果】 一、鏈霉菌形態(tài)觀察記錄表菌種基內(nèi)菌絲氣生菌絲孢子絲青色鏈霉菌菌絲較長，較疏松，多分枝毛狀螺旋狀，末端有弗氏鏈霉菌菌絲直或折曲，較密，多分枝厚絮狀直鏈狀，末端有圓形孢子二、鏡檢結(jié)果氣生菌絲（暗）基內(nèi)菌絲（明） 圖4：弗氏鏈霉菌（10*40） 圖5：弗氏鏈霉菌局部放大圖 圖6：弗氏鏈霉菌孢子絲氣生菌絲（暗）基內(nèi)菌絲（明） 圖7：青色鏈霉菌（10*40） 圖8：青色鏈霉菌局部放大圖 圖9：青色鏈霉菌孢子絲【實驗小結(jié)】1、鏈霉菌的菌落特征：經(jīng)過鏡檢，可觀察到放線菌菌絲呈分枝絲狀，且多交錯在一起，由基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲三部分組成，基內(nèi)菌絲透明，有較多的分枝，而氣生菌絲較暗。兩種菌絲在不同的焦平面上，可通過調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋分別進(jìn)行觀察。放線菌有與細(xì)菌不同的菌落特征：干燥、不透明，表面呈緊密的絲絨狀，菌落和培養(yǎng)基的連接緊密，難以挑取菌落。2、為何采用插片觀察法：放線菌菌落小，與培養(yǎng)基結(jié)合較緊密，不易用接種鉤挑取，因而難以直接觀察。而采用插片法，在接種放線菌的培養(yǎng)基一側(cè)，以45角插入無菌蓋玻片，使放線菌沿培養(yǎng)基與蓋玻片交界處生長，并附著于蓋玻片上，待菌絲生長一段時間后，可直接取下蓋玻片進(jìn)行染色觀察。該方法可以進(jìn)行放線菌營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的比較觀察。3、為何采用高氏一號培養(yǎng)基：這是一種半合成培養(yǎng)基，采用可溶性淀粉為碳源、KNO3為氮源。因為缺乏速效的碳源和氮源，該培養(yǎng)基的營養(yǎng)較為匱乏，有利于放線菌產(chǎn)生孢子。同時，由于鏈霉菌生長較慢，因此用來培養(yǎng)鏈霉菌的培養(yǎng)基平板要比培養(yǎng)細(xì)菌的要厚一些。4、實驗操作時應(yīng)注意哪些：倒平板要稍厚一些，接種時劃線要密，最好用記號筆標(biāo)好劃線方向，插片時與劃線方向相垂直，這樣可防止插到劃線的空隙上，較容易使菌絲長在蓋玻片上。鏡檢時，宜用略暗光線，先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察。低倍鏡觀察時，菌面應(yīng)該朝上，不然菌體會被壓扁，不好觀察。換用油鏡觀察，要把菌面朝下，否則滴加香柏油后，菌體會滑動影響觀察且會污染鏡頭?！舅伎寂c討論】 1.鏡檢時如何區(qū)分放線菌基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及孢子絲？答：在光學(xué)顯微鏡下觀察，氣生菌絲在上層、較明亮，基內(nèi)菌絲在下層、顏色較暗，氣生菌絲較基內(nèi)菌絲粗。有些氣生菌絲發(fā)育到一定