微生物學實驗講義.doc

生物學實驗微生物（2008級基地班）任課教師： 熊 芳教學時數： 15學時實驗周數： 4周 生物學實驗教學中心微生物實驗目錄（15學時）微生物實驗基礎知識介紹實驗一：培養(yǎng)基的配制與滅菌（4學時）實驗二：土壤自生固氮菌的分離純化（5學時）實驗三：顯微鏡的使用和簡單染色（3學時）實驗四：革蘭氏染色和莢膜染色（3學時）第一次實驗：微生物學實驗基礎知識一、實驗目的1.熟悉實驗室規(guī)則和安全守則，正確應對實驗中出現(xiàn)的意外事故；2.認識微生物學實驗室常用儀器和有關試劑的基本知識；3.掌握實驗報告的正確書寫。二、實驗內容1.實驗室規(guī)則；2.實驗室安全守則；3.實驗室中意外事故處理；4.常用器皿及用具；5.顯微鏡及有關知識；6.實驗預習、實驗記錄和實驗報告。實驗一 培養(yǎng)基的配制和高壓蒸汽滅菌配置培養(yǎng)基的基本流程如下：原料稱量溶解調節(jié)pH值過濾澄清分裝塞硅膠塞和包扎滅菌培養(yǎng)基的配制原則一、營養(yǎng)成分1. 根據不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基，如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應該）由簡單的無機物質組成。異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機物質。碳源物質的功能：構成細胞物質；為機體提供整個生理活動所需要的能量（異養(yǎng)微生物）。氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物營養(yǎng)所需的氮元素的營養(yǎng)源，稱為氮源。氮源物質的主要作用是合成細胞物質中含氮物質，少數自養(yǎng)細菌能利用銨鹽、硝酸鹽作為機體生長的氮源與能源，某些厭氧細菌在厭氧與糖類物質缺乏的條件下，也可以利用氨基酸作為能源物質。能源 指能為微生物的生命活動提供最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能。2. 注意各種營養(yǎng)物質的濃度與配比 營養(yǎng)物的濃度：在一般情況下，濃度合適的營養(yǎng)物質才對微生物表現(xiàn)出良好作用，濃度大時對微生物生長起抑制作用，濃度小時不能滿足微生物生長的需要。 各營養(yǎng)物質之間的濃度比：培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質之間的濃度比直接影響微生物的生長與繁殖和（或）代謝產物的形成與積累，尤其是碳氮比（CN）（碳氮比一般指培養(yǎng)基中元素碳與元素氮的比值，有時也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白兩種成分含量之比）的影響更為明顯。二、控制培養(yǎng)基的PH值 各類微生物生長的最適pH各不相同，細菌與放線菌生長的pH在7-7.5之間，酵母菌與霉菌生長的pH值在4-5之間。 在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質的利用和代謝產物的形成與積累，常會改變培養(yǎng)基的pH值，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定，通常采用下列兩種方式：內源調節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調節(jié)：按實際需要流加酸或堿液三、滲透壓注意營養(yǎng)物質要有適合的濃度，不能太低滿足不了生長的需要，太高則滲透壓太大，也會抑制微生物的生長四、氧化還原電位氧化還原電位越高，培養(yǎng)基的氧化活動越強，在厭氧菌培養(yǎng)中，加入還原劑，可降低自由氧的毒害。培養(yǎng)基的種類據組成成分可分為:1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質按一定比例配制而成。是一類按微生物的營養(yǎng)要求精確設計后用多種高純化學試劑配制成的培養(yǎng)基。如葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基等。2.半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。例如，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。 3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑（常用凝固劑為瓊脂）的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入1-2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農副產品培養(yǎng)基。 3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.20.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。按照培養(yǎng)基的用途，可將其分為1.加富培養(yǎng)基：加富培養(yǎng)基是指在普通培養(yǎng)基里加過血、血清、動物（或植物）組織液或其他營養(yǎng)物質（或生長因子）的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物。2.選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基是根據某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要或對某種化合物的敏感性不同而設計出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。3.鑒別培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產物發(fā)生反應的指示劑或化學藥品，從而產生某種明顯的特征性變化，以區(qū)別不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備一、 實驗原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，所以可供作微生物生長繁殖之用?；A培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量的瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96時溶化，實際應用時，一般在沸水浴中或下面墊以石棉網煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據瓊脂的質量和氣溫的不同而有所不同。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH值調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mlpH 7.47.6。二、 實驗器材1、 溶液和試劑 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。2、 儀器或其他用具 試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩/皮筋，紗布等。三、 操作步驟1、 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。2、 溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱，或在磁力攪拌器上加熱溶解。將藥品完全溶解后，補充水到所需要的總體積，如果配置固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所損失的水分。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然后按1.5%2.0%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同時進行，節(jié)省時間。在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷地攪拌，以防瓊脂培糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養(yǎng)基中。3、 調pH在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達7.6。反之，用1mol/LHCl進行調節(jié)。對于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調節(jié)可用酸度計進行。pH不要調過頭，以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。配置pH低的瓊脂培養(yǎng)基時，若預先調好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解而不能凝固。4、過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結果的觀察。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。5、分裝按實驗要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內或三角燒瓶中。（1） 液體分裝 分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準確。（2） 固體分裝 分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的量以不超過三角瓶容積的一半為宜。（3） 半固體分裝 試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。6、 加塞 a) 包扎：加塞后，將全部試管用麻繩/皮筋捆好，再外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕塞，其外再用一道麻繩/皮筋扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配置日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配置日期。（有條件的實驗室，可用市售的鋁箔代替牛皮紙，省去用繩扎，而且效果好。）b) 滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.103Mpa,121，20min高壓蒸氣滅菌。c) 擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50左右（以防斜面上冷凝水太多），將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。d) 無菌檢查：將滅菌培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2428h，以檢查滅菌是否徹底。阿斯畢無氮培養(yǎng)基甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g瓊脂 20g水 1000mlPH 7.07.2 121 滅菌30分鐘高壓蒸汽滅菌一、目的要求1了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍。2學習高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出226kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。實驗室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種，其構造如圖。本實驗介紹手提式和立式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。三、器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，阿斯畢無氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿，立式高壓蒸汽菌鍋等。四、操作步驟1首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用 105kg/cm2，1213，20分鐘滅菌。5滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。6將取出的滅菌培養(yǎng)基放入 37溫箱培養(yǎng)24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。五、實驗報告1結果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。2思考題（1）高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么要待壓力降到0時才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，怎樣杜絕一切不安全的因素？第二次實驗：實驗二 土壤自生固氮菌的分離和純化一、實驗目的：1、學習微生物的純系分離、培養(yǎng)方法；2、掌握稀釋分離、劃線分離、涂抹分離純化微生物的方法。二、基本原理： 為了生產和科學的需要，往往需要從自然界混雜的微生物群中分離單一的菌種，這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物分離。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，可采用下列兩種方法：一種是提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。如要從土壤中分離自生固氮菌，則培養(yǎng)基中是不能含有N源，這種培養(yǎng)基就比較適合能利用空氣中N2的微生物。另一種方法是在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以抑制人們不需要的微生物的生長繁殖。分離土壤中的真菌，往往在分離真菌的馬丁培養(yǎng)基中加入適當的孟加拉紅、鏈霉素和金霉素等化學藥品，目的在于抑制細菌的生長，這樣更有利于獲得純培養(yǎng)。土壤中微生物數量眾多，在肥沃土壤中固氮菌數量也很多，自然界中多數氮素養(yǎng)料是有微生物固氮的結果，固氮菌一般可分為自生固氮菌和共生固氮菌兩類。要分離自生固氮菌，常用阿斯畢無氮培養(yǎng)基這種選擇性培養(yǎng)基，控制其適宜的環(huán)境條件，使它在培養(yǎng)基上大量繁殖，然后通過稀釋法或劃線分離法，使它在培養(yǎng)基上形成單菌落，若分離得不純，需要進一步純化，直到得到純種。三、 實驗材料1、 培養(yǎng)基：阿斯畢（Ashby）無氮培養(yǎng)基2、 菜園土3、 滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、接種針、酒精燈等。四、 方法與步驟：（一） 富集培養(yǎng)：（第二次實驗做）1、 用已滅菌后冷卻至50左右的阿斯畢培養(yǎng)基倒平板。2、 用已滅菌的鑷子將黃豆粒大的菜園土擺入已冷凝的平板培養(yǎng)基上。3、 正面放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28培養(yǎng)3-4天后，在土粒周圍有渾濁半透明的膠狀菌落出現(xiàn)，有的在后期會產生褐色的色素。（二） 劃線分離純化：（第三次實驗做）1、 用已溶化至50的阿斯畢培養(yǎng)基倒平板；2、 用接種環(huán)挑取上述菌落少許，在冷凝平板上進行劃線分離，而后置于28培養(yǎng)4天。劃線方法如圖： A:交叉劃線法（1、2、3、4為依次劃線的起點）B：連續(xù)劃線法（1、2為依次劃線的起點）（三） 純化、鏡檢，得到純種培養(yǎng)（第四次實驗做）1、平板上出現(xiàn)單菌落，按無菌操作移入阿斯畢培養(yǎng)基斜面試管中，28培養(yǎng)4天，即獲得純培養(yǎng)菌，可冷凍保存，備用；（要求每人至少保存自生固氮菌的一支斜面試管，并貼好標簽。）2、鏡檢：將斜面菌株進行涂片、染色、鏡檢。如是粗短桿狀或球狀的單一形態(tài)的菌體細胞較大，常呈單個或“8”字排列，在細胞表面有較厚的莢膜者，即為自生固氮菌。若有雜菌，需要進一步劃線純化。注意事項：1） 微生物分離、純化這一操作環(huán)節(jié)，要嚴格按照無菌操作進行。2） 平板劃線時，劃線部位不可重疊；3） 劃線時，每次都要將接種環(huán)上多余菌體燒掉。第四次實驗：實驗三 顯微鏡的使用（詳見細胞生物實驗指導）和細菌的簡單染色法一、目的與要求：1學習微生物涂片、染色的基本技術。 2掌握細菌的簡單染色法。 3初步認識細菌的形態(tài)特征，鞏固學習油鏡的使用方法和無菌操作技術。 二、原理： 細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術。微生物的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結構。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。 常用堿性染料進行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍、結晶紫、堿性復紅等。 當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。 染色前必須固定細菌。其目的有二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形態(tài)。 三、材料 1菌種：大腸桿菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2染色劑：石炭酸復紅染液或草酸銨結晶紫染液。 3儀器或其他用具 顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。 四、流程 涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢。五、 步驟 1涂片 ：取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作，分別從大腸桿菌和金黃色葡萄球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養(yǎng)物)涂片，可用接種環(huán)挑取23環(huán)直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。 2干燥：室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會破壞菌體形態(tài)。 3固定：如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。涂片、干燥和熱固定。 4染色：將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液12滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍染色12min，石炭酸復紅(或草酸銨結晶紫)染色約1min。 5水洗： 傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。 6干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。 7鏡檢：涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。 六 結果 ： 繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態(tài)圖。實驗四 細菌的革蘭氏染色和莢膜染色革蘭氏（Gram,s）染色法一、實驗原理革蘭氏染色法是細菌學上一種重要的鑒別染色法。用這種染色法可以把細菌分為兩大類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。該法所用的染料是用兩種不同性質的染料草酸銨結晶紫和番紅染液。細菌先用草酸銨結晶紫進行初染，經碘液媒染后，再用95乙醇（或丙酮乙醇）脫色，最后用番紅復染。如細菌保持草酸銨結晶紫與碘復合物的顏色而不被乙醇脫色，則細菌呈紫色，稱為革蘭氏陽性菌，該反應稱為革蘭氏陽性或正反應（用G+表示）；如細菌能被乙醇脫色而又能被番紅染成紅色的稱為革蘭氏陰性菌，其反應則稱為革蘭氏陰性或負反應（G-表示）。革蘭氏染色反應的機理，初染時,在細胞膜內形成草酸銨結晶紫與碘復合物, G+細胞壁厚,肽聚糖網層次多和交聯(lián)致密, 95乙醇（或丙酮乙醇）處理時,使網孔縮小,再加上它不含類脂.故乙醇處理后復合物不會溶出縫隙.反之, G-細胞壁薄,外膜層的類脂含量高, 肽聚糖網層次多和交聯(lián)差,以類脂為主的外膜溶解,薄而松散的肽聚糖網不能阻擋復合物的溶出.主要是由于兩類細菌的細胞壁成分和結構不同，因而對結晶紫碘復合物的滲透性不同，導致了不同染色反應。芽孢桿菌和絕大多數球菌（以及所有的放線菌和酵母菌）都呈革蘭氏陽性反應，而大多數無芽孢桿菌弧菌螺旋菌和某些球菌則呈革蘭氏陰性反應。因此，革蘭氏染色法在細菌的分類鑒定和生產應用上具有重要意義。有些特殊的細菌，革蘭氏染色反應不穩(wěn)定，稱為革蘭氏不定細菌（Gram variable bacteria）。二、實驗材料1第二周分離得到的微生物;2培養(yǎng)24小時的大腸桿菌（E.coli），金黃色葡萄球菌;3載玻片接種環(huán)酒精燈及火柴赫克爾（Hucker）氏結晶紫染色液路戈（Lugol）氏碘液95乙醇番紅染色液吸水紙顯微鏡。三、操作步驟（一）涂片1混合涂片法：取一潔凈載玻片，滴一小滴蒸餾水于玻片中央。按無菌操作要求，先用接種環(huán)挑取少量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物于玻片中央水滴中，涂布均勻。接種環(huán)經灼燒滅菌冷卻后，再挑取少量大腸桿菌培養(yǎng)物，混涂于玻片中央枯草芽孢桿菌菌液中，制成混合涂片。要求涂片薄而均勻。2三區(qū)涂片法：在一潔凈載玻片近兩端各滴一小滴蒸餾水，按無菌操作要求，先用接種環(huán)取少量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)