高效毛細管電泳法在藥物分析中的應用

2017/11/2,高效毛細管電泳法在藥物分析中的應用,山東藥品食品職業(yè)學院 任玉紅,2010年執(zhí)業(yè)藥師繼續(xù)教育,2017/11/2,該內(nèi)容共分兩部分進行介紹第一部分 概述第二部分 高效毛細管電泳技術的分離模式及應用,2017/11/2,第一部分 概述 高效毛細管電泳法(HPCE )又稱毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE）。 是以毛細管為分離通道，以高壓電場為驅(qū)動力，依據(jù)供試品中各組分之間淌度（單位電場強度下的遷移速度）和（或）分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的新型液相分離分析技術。,2017/11/2,1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白；第一次的自由溶液電泳； 一臺電泳儀;,Tiselius建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術。 1948年獲得諾貝爾化學獎。,2017/11/2,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術高效毛細管電泳。 19881989年出現(xiàn)了第一批毛細管電泳商品儀器。,目前，在生命科學、藥物分析、以及從小分子、離子到單細胞分析的一系列領域得到了廣泛的應用。,2017/11/2,一、高效毛細管電泳法的特點,高效毛細管電泳法是經(jīng)典電泳技術和現(xiàn)代微柱分離相結合的產(chǎn)物。 與高效液相色譜法（HPLC）相比，其相同處在于都是高效分離技術，儀器操作均可自動化，且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：HPCE用遷移時間取代HPLC中的保留時間，HPCE與HPLC相比，分析速度快；柱效高；所需樣品量及流動相用量少；但HPCE僅能實現(xiàn)微量制備，而HPLC可作常量制備；同時，HPCE沒有泵輸液系統(tǒng)，因此成本相對較低，通過改變操作模式和緩沖液的成分，有很大的選擇性，可以根據(jù)不同分子性質(zhì)（諸如大小、電荷數(shù)、疏水性等）對極廣泛的對象進行有效的分離。而HPLC為達到同樣的目的，需要消耗價格昂貴的柱子和大量的溶劑。,2017/11/2,HPCE和普通電泳相比，由于其采用高電場，因此分離速度快；檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外，其它類型檢測器均已和HPCE實現(xiàn)了連接檢測；一般電泳定量精度差，而HPCE和HPLC相近；HPCE操作自動化程度比普通電泳要高，與傳統(tǒng)的電泳相比主要有四個特點，即高效、快速、微量和自動化。,2017/11/2,毛細管電泳技術兼有高壓電泳及高效液相色譜等優(yōu)點，其突出特點是:,1.儀器簡單、易自動化 電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)3.操作模式多，開發(fā)分析方法容易 4.操作方便、消耗少 進樣量極少，水介質(zhì)中進行5.應用范圍極廣,2017/11/2,二、毛細管電泳的基本裝置與操作,毛細管電泳的基本裝置由高壓電源、毛細管、檢測器、電解質(zhì)貯液槽、進樣器、控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。,1溫度控制系統(tǒng)；2高壓電源；3高壓電極槽；4毛細管；5檢測器；6低壓電極槽；7鉑絲電極；8記錄/數(shù)據(jù)處理檢測器,2017/11/2,幾個主要部分的特點:,進樣：最常用的進樣方式為流體力學方式和電動方式兩種。 分離：分離部件主要包括毛細管、毛細管恒溫系統(tǒng)和電源。毛細管材料應具有化學和電學惰性、紫外可見光透光性、柔韌性、強度高和便宜等特性。熔融石英是毛細管的首選材料，最常用的是內(nèi)徑為2575m的毛細管。 檢測：紫外可見光檢測是最常用的檢測方式，但是受到儀器、單波長等因素的限制，目前應用最廣泛的是二極管陣列（PDA）檢測器。 液體的處理：該系統(tǒng)包括自動進樣裝置、緩沖液更換系統(tǒng)和緩沖液的水平系統(tǒng)等。,2017/11/2,完成典型的HPCE實驗，一般包括以下操作步驟：,移開進樣端的電解質(zhì)貯液槽，換上樣品管使用低壓或電遷移方式進樣換電解質(zhì)貯液槽加上分離電壓樣品分離，用檢測器進行檢測,2017/11/2,電泳 是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動的現(xiàn)象。單位電場下的電泳速度稱為淌度或電遷移率。 離子所帶電荷越多，解離度越大，體積越小，溶液粘度越小，有效淌度就越大，其電泳速度就越快。這也是電泳分離及其條件選擇的根本依據(jù)之一。,物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。,三、毛細管電泳法的基本理論,2017/11/2,電滲 高效毛細管電泳操作中一個基本組成部分是電滲流（electroosmosis，EOF）。電滲流是毛細管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動，來源于外加電場對管壁溶液雙電層的作用。 CE所用的石英毛細管柱，在pH3的情況下，其內(nèi)表面帶負電，和溶液接觸時形成雙電層。在高電壓的作用下，雙電層中的水合陽離子引起流體整體向負極方向遷移的現(xiàn)象叫電滲。 電滲流是毛細管中的溶劑因軸向直流電場的作用而發(fā)生的定向流動。,2017/11/2,電滲流的方向,電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極； 粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流（EOF）兩種速度的矢量和，正離子的運動方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當于電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離。,2017/11/2,多數(shù)情況下，電滲流速度是電泳速度的5-7 倍。 因此，在毛細管電泳中利用電滲流可將正、負離子和中性分子一起朝一個方向產(chǎn)生差速遷移，在一次CE 操作中同時完成正、負離子的分離測定。由于電滲流的大小和方向可以影響CE 分離的效率、選擇性和分離度，所以成為優(yōu)化分離條件的重要參數(shù)。用來控制電滲流的方法主要有改變緩沖溶液的成分和濃度；改變緩沖溶液的pH 值；加入添加劑；毛細管內(nèi)壁改性；外加徑向電場；改變溫度等。,2017/11/2,四、影響高效毛細管電泳分離的因素,1.緩沖溶液 CE中常用的緩沖試劑有：磷酸鹽、硼砂或硼酸、醋酸鹽等。緩沖液濃度升高，離子強度增加，電滲流減小，分析效率提高；同時，增強樣品的富集現(xiàn)象，從而提高分析靈敏度。,2pH值 pH能影響樣品的解離能力，樣品在極性強的介質(zhì)中離解度增大，電泳速度也隨之增大，從而影響分離選擇性和分離靈敏度。,2017/11/2,3. 分離電壓 相對較高的分離電壓會提高分離度和縮短分析時間，但電壓過高又會使譜帶變寬而降低分離效率。,4. 溫度的影響,毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。5. 添加劑的影響6. 進樣,2017/11/2,第二部分 高效毛細管法的分離模式及應用,2017/11/2,一、高效毛細管電泳的分離模式,1、毛細管區(qū)帶電泳(CZE)2、毛細管凝膠電泳(CGE)3、毛細管等速電泳(CITP)4、毛細管等電聚焦(CIEF)5、膠束電動毛細管色譜(MEKC或MECC)6、毛細管電色譜 (CEC),2017/11/2,1、毛細管區(qū)帶電泳 CZE,將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。 正離子在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子在負極最后流出，在這種情況下，不但可以按類分離，同種類離子由于差速遷移被相互分離。,CZE最基本的操作模式，應用最廣泛，是其它各種操作模式的母體。用以分析帶電溶質(zhì)，如多種蛋白質(zhì)、肽、氨基酸的分析。,2017/11/2,2、毛細管凝膠電泳 CGE,將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。 特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 毛細管凝膠電泳分凝膠和無膠篩分兩類。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺,稱為毛細管無膠篩分。柱便宜、易制備。,2017/11/2,CGE 是毛細管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式 ，用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結構，按分子的大小分離,2017/11/2,1） 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。 2）負離子分析時，前導電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。,3、毛細管等速電泳 capillary isotachophoresis ，CITP,2017/11/2,3）不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(=E)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度小，使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離。 4）特點：界面明顯，富集、濃縮作用；常用于分離離子型物質(zhì)，目前應用不多。,2017/11/2,1)緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。,4、 膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）,在電場力的作用下，膠束在柱中移動。被分離物質(zhì)在水和膠束相之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細管內(nèi)遷移，達到分離。,2)電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負電膠束以較慢的速度向負極移動；,2017/11/2,3)中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長； 特點：1）可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；2)色譜與電泳分離模式的結合。,2017/11/2,1） 根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術； 2） 毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的、穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的 pH梯度； 3）氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；,5、毛細管等電聚焦 CIEF,2017/11/2,4）聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；,5）陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液； 6）加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測； 7）電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。 毛細管等電聚焦電泳已經(jīng)成功用于測定蛋白質(zhì)等電點，分離異構體等方面。,2017/11/2,是將細粒徑固定相填充到毛細管中，或在毛細管內(nèi)壁涂覆固定相，以電滲流驅(qū)動操作緩沖溶液（流動相），使試樣組分在兩相間進行分離的電動色譜過程。此模式兼具電泳和液相色譜的模式。CEC可分為開管CEC（即管壁涂漬固定相）和填充CEC。,6、毛細管電色譜 capillary electroosmostic chromatography ，CEC,2017/11/2,二、高效毛細管電泳法在藥物分析中的應用,高效毛細管技術在藥物分析中的應用大致可以分為兩部分：一是原料藥的定量、原料藥中雜質(zhì)的測定、藥物制劑分析以及對它們穩(wěn)定性的評價等以藥品質(zhì)量控制為目的的測定方法。二是對進入人體內(nèi)的藥物或代謝物的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)動態(tài)的研究，即臨床藥物分析。,2017/11/2,（一）HPCE在藥品質(zhì)量控制方面的研究應用,1HPCE在中藥分析中的應用 具有分離效率高、分析速度快、分析時間短、樣品前處理簡便、進樣量少、有機溶劑消耗少、操作簡便、分析成本低等優(yōu)點。另外，HPCE在中藥復方制劑復雜成分分析中還具有以下優(yōu)越性：(1)毛細管柱易于全面清洗，可保持高柱效而使復雜成分較好分離；(2)分離模式多，適合于中藥制劑中各類化學成分的分析；(3)不同電泳技術之間及HPCE與NMR、MS等多種技術聯(lián)用可提高分析的精密度，更可拓寬其應用范圍。,2017/11/2,目前已有報道，采用HPCE對丸劑、膠囊劑、片劑、合劑、口服液、顆粒劑以及注射劑等中藥制劑或中藥中有效成分進行分析。例如，用膠束電動毛細管色譜（MECC）法測定牡丹皮、白芍、赤芍及其不同炮制品的牡丹酚、芍藥甙的含量；選擇毛細管區(qū)帶電泳（CZE）分離模式，以麻黃素為內(nèi)標，建立了適合莨菪類生物堿一阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、樟柳堿優(yōu)化分離與顛茄酊劑及片劑定量分析的方法，可用于莨菪類生物堿中藥制劑的質(zhì)量控制等。 由此可見，HPCE在中藥制劑質(zhì)量控制及中藥現(xiàn)代化進程中必將發(fā)揮巨大作用。,2017/11/2,2HPCE在天然產(chǎn)物分析中的應用（1）蛋白質(zhì)、DNA、多肽、氨基酸的分析： 主要包括肽、蛋白的鑒別、結構分析、微量制備以及蛋白的定量測定、純度檢測；測定氨基酸的組成、序列和一些物化常數(shù)（如分子量和等電點等）、鑒別結構和種類不同的蛋白質(zhì)。在肽和蛋白質(zhì)的鑒別分析中應用最多的是CZE。對擴散系數(shù)小的生物大分子而言，CE還可以作為收集非常純的單一餾分的微量制備的手段。 例如分離多聚核苷酸并對產(chǎn)物進行純度測定等，結果使人滿意。,2017/11/2,采用MEKC模式，在25分鐘內(nèi)分離了23種丹?；被?；HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀,實例1：,2017/11/2,DNA排序,實例2：,2017/11/2,（2）糖及其綴合物的分析 糖分析的難點是糖類物質(zhì)一般為電中性，且親水性強，多數(shù)沒有吸光基團，檢測上存在困難。 各種新的糖衍生化反應和檢測技術的應用，使CE成為分析單糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖類化合物的有效手段。單糖的解離常數(shù)值一般大于11，需選用pH11強堿性的緩沖液，直接進行電泳分離后紫外檢測。這種方法也能用來測定簡單寡糖。多糖一般利用酸解或酶解的方法將其轉化為寡糖后進行分析。,2017/11/2,在糖的檢測方面，UV，EC和LIF（激光誘導熒光）是主要手段。例如：葡萄糖、果糖、綿子糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、水蘇糖等單糖可以利用CZE，膠束電動毛細管色譜（MECC）結合UV進行檢測；寡糖和多糖主要采用CZE結合EC的方法進行檢測；其他糖類（氨基糖等）則選擇LIF（激光誘導熒光）檢測。,2017/11/2,3HPCE在藥物制劑分析中的應用,CE法具有能排除高含量復雜基體干擾、檢測痕量成分的能力，且樣品只需經(jīng)簡單預處理即可分析其有效成分含量，現(xiàn)已廣泛應用于片劑、注射劑、糖漿、滴耳液、乳膏劑及復方制劑等各種劑型中主藥成分的定量測定。 如有文獻報道用低pH值的緩沖液測定糖漿中堿性主藥的含量時，因賦形劑呈中性，將停留在進樣端不遷移而在清洗時被沖走，故可將糖漿樣品稀釋后直接進樣，無需前處理。,2017/11/2,例如，采用此方法，經(jīng)過篩選比較，確定緩沖液pH3.0，在HPCE柱上富集測定福莫特羅干糖漿；采用CZE技術測定