昆蟲sf9細胞培養(yǎng).docx

。Sf9培養(yǎng)要點：溫度：27-28攝氏度pH：，sf9最適的pH6.2，隨培養(yǎng)時間的延長，Ph值會增加傳代時間：72h（三天左右）細胞來源：Sf9（貨號B825-01）和Sf21（貨號B821-01）細胞系是傳統(tǒng)的用于桿狀病毒表達的細胞系，源于美國農業(yè)部昆蟲病理實驗室。此細胞系適用于InsectSelect系統(tǒng)。這兩株細胞衍生于IPLBSF-21細胞系，來源于秋蠅蠕蟲（草地夜蛾）蛹的卵巢組織。（以上來自invitrogen）細胞特點：規(guī)則的帶有顆粒球形。貼壁緊。標準條件的定義：培養(yǎng)最低密度：0.6106/ml（健康對數(shù)生長期細胞活率至少應不低于90?；盥实陀?0細胞不是在最佳條件下培養(yǎng)不能用于實驗）1106/mL將出現(xiàn)對數(shù)生長狀態(tài)傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)需將細胞調整到維持對數(shù)生長狀態(tài)和最大活率。貼壁培養(yǎng): 貼壁細胞傳代需在細胞長成單層（如下定義）然后1：5（細胞體積：最后培養(yǎng)基體積）稀釋維持對數(shù)生長。形成單層細胞可以傳代培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)：在細胞密度達到2.0106-2.5106細胞/mL后將密度調整至0.7106-1.0106細胞/mL進行懸浮傳代。確保傳代細胞密度不高于4106個/mL或保持密度高于1106個/mL以達到對數(shù)生長狀態(tài)。Sf9懸浮培養(yǎng)所需要的細胞數(shù)培養(yǎng)基：sf-900 SFM（添加2%的血清減小感染過程中蛋白水解量）培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)體積：凍存：一旦細胞系建立且倍增規(guī)律則可以進行凍存。細胞需達到90活率和80-90融合的要求（如：低代次）推薦凍存幾管。當融解細胞，它將會達到最佳使用狀態(tài)。1. 用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。需要足夠的如上表所示密度的細胞凍存2-4管。細胞可是懸浮或貼壁培養(yǎng)；2. 將無菌凍存管立于冰上，做好標記；3. 室溫400-600g離心10min。移除上清。4. 以給定的密度在凍存液中重懸細胞；5. 移取1mL細胞懸液置于無菌凍存管中；6. 置于-201h，然后移至-8024-48h；7. 儲存于液氮中。轉染的細胞：需要的是對數(shù)期的細胞95%發(fā)育能力，可以完成成功的轉染。載氧：對于最優(yōu)生長條件和蛋白的表達，昆蟲細胞要求被動的通氧。積極的通氧系統(tǒng)要求溶氧飽和在10%-50%Sf900II和sf900的區(qū)別：一般推薦Sf900II來大量表達蛋白Sf900II含有表面活性劑（剪切力保護劑（保護細胞在轉瓶中培養(yǎng)時不會受到剪切力傷害）當設計純化多聚組氨酸標簽蛋白的計劃時，注意無血清培養(yǎng)基不能直接用于螯合樹脂，因為培養(yǎng)基的成分會除去樹脂中的鎳離子。細胞培養(yǎng)的一般順序：復蘇傳代傳代穩(wěn)定凍存應當遵循的一般過程：復蘇貼壁培養(yǎng)懸浮懸浮擴大培養(yǎng)（產生目標蛋白）（也可不經過貼壁培養(yǎng)，直接懸浮培養(yǎng)）貼壁時間：45min懸浮的轉速：80rpm附：離心機rcf與g的換算：無血清培養(yǎng)基可以選擇性加入一定的抑菌劑防止細菌或者真菌污染：培養(yǎng)基：GIBCO-SFM900 加青霉素鏈霉素抑制細菌生長兩性霉素B抑