醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第五部分 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn).doc

.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)1 范圍GB/T 16886 的本部分闡述了評(píng)價(jià)醫(yī)療器械體外細(xì)胞毒性的試驗(yàn)方法。這些方法規(guī)定了下列供試品以直接或通過擴(kuò)散的方式與培養(yǎng)細(xì)胞接觸和進(jìn)行孵育；a）用器械的浸提液，和或b）與器械接觸。這些方法是用相應(yīng)的生物參數(shù)測定哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外生物學(xué)反應(yīng)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過GB/T 16886 的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本部分達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。GB/T 16886. 1 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1部分：評(píng)價(jià)與試驗(yàn)（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997）CB/ T 16886. 12-2000 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備和參照材料（idt ISO 10993-12 :1996）3 術(shù)語與定義GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中確立的以及下列術(shù)語和定義適用于本部分。3.1陰性對(duì)照材料 negative control material按照本部分試驗(yàn)時(shí)不產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料。注：陰性對(duì)照的目的是驗(yàn)證背景反應(yīng)，例如高密度聚乙烯1） 已作為合成聚合物的陰性對(duì)照材料，氧化陶瓷棒則用作牙科材料的陰性對(duì)照物。3.2陽性對(duì)照材料 positive control material按照本部分試驗(yàn)時(shí)可重現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料。注：陽性對(duì)照的白目的是驗(yàn)證相應(yīng)試驗(yàn)系統(tǒng)的反應(yīng)，例如用有機(jī)錫作穩(wěn)定劑的聚氯乙烯2）已用作固體材料和浸提液的陽性對(duì)照，酚的稀釋液用于浸提液的陽性對(duì)照。_1) 高密度聚乙烯可從美國藥典委員會(huì)（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和藥品安全中心（Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan）獲得。提供這一信息是為本部分的使用者提供方便，但I(xiàn)SO對(duì)使用該產(chǎn)品不提供擔(dān)保。2) 有機(jī)錫聚氯乙烯陽性對(duì)照材料可從SIMS Portex Ltd,Hythe, Kent,CT21 6JL,UK（產(chǎn)品號(hào)碼499-300-000）獲得。ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可從Hatano 研究所食品和藥品安全中心（Ochiai 729-5 , Hanagawa257-Japan) 獲得。提供這一信息是為本部分的使用者提供方便，但I(xiàn)SO 對(duì)使用該產(chǎn)品不提供擔(dān)保。3.3試劑對(duì)照 reagent control在不加試驗(yàn)材料的條件下，按浸提條件和試驗(yàn)步驟得到的浸提介質(zhì)。注：在本部分中，該定義取代 GB/T 16886. 12/ lSO 10993-12中3.1給出的定義。3.4 培養(yǎng)器皿 culture vessels適用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，包插玻璃培養(yǎng)皿、塑料培養(yǎng)瓶或塑料多孔培養(yǎng)板和微量滴定板等器皿。注，在這些試驗(yàn)方法中，這些器皿只要符合組織培養(yǎng)級(jí)別的要求，并適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可以互換使用。3.5近匯合 subconfluency在對(duì)數(shù)生長期末，約80% 的細(xì)胞匯合。4 樣品制備4.1 總則供試品可選用：a）材料浸提液；和或B）材料本身。樣品制備應(yīng)符合CB/T 16886. 12/ISO 10993-12。4.2 材料浸提液的制備4.2.1 浸提原則為了測定潛在的毒理學(xué)危害，浸提條件應(yīng)模擬或嚴(yán)于臨床使用條件，但不應(yīng)導(dǎo)致試驗(yàn)材料發(fā)生，諸如熔化、溶解或化學(xué)結(jié)構(gòu)改變等明顯變化。注：浸提液中任何內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的濃度及其接觸試驗(yàn)細(xì)胞的量取決于接觸面積、浸提體積、pH、化學(xué)溶解度、擴(kuò)散率、溶質(zhì)度、攪拌、溫度、時(shí)間和其他因素。4.2.2 浸提介質(zhì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞檢測中應(yīng)使用下列一種或幾種溶劑。對(duì)浸提介質(zhì)的選擇應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證：a) 含血清培養(yǎng)基；b) 無血清培養(yǎng)基；c) 生理鹽水溶液；d) 其他適宜的溶劑。注：溶劑的選擇應(yīng)反映出浸提的目的，并應(yīng)考慮使用極性和非極性兩種溶劑。適宜的溶劑包括純水、植物油、二甲基亞砜（DMSO）。在所選擇的測試系統(tǒng)中如DMSO 濃度大于0.5% （體積分?jǐn)?shù)），則有細(xì)胞毒性。4.2.3 浸提條件4.2.3.1 浸提應(yīng)使用無菌技術(shù)，在無菌、化學(xué)惰性的封閉容器中進(jìn)行，應(yīng)符合GB/ T 16886. 12/lSO 10993-12 的基本要求。4.2.3.2 推薦的浸提條件是：a) 372下不少于24 h；b) 502下72 h2 h；c) 702下24 h2 h；d) 1212下1 h士0. 2 h?？筛鶕?jù)器械特性和具體使用情況選擇推薦的條件。當(dāng)浸提過程使用含血清培養(yǎng)基時(shí)，只能來用4. 2. 3. 2 a）規(guī)定的浸提條件。4.2.3.3 浸提液用于細(xì)胞之前，如果進(jìn)行過濾、離心或其他處置方法，最終報(bào)告（見第9章）中應(yīng)予以說明，對(duì)浸提液pH值的調(diào)整也應(yīng)在提告中說明。對(duì)浸提撞的處理，例如對(duì)pH值的調(diào)整會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。4.3 直接接觸試驗(yàn)材料的制備4.3.1 在細(xì)胞毒性檢測中，多種形狀、尺寸或物理狀態(tài)（即液態(tài)或固態(tài)）的材料未經(jīng)修整即可進(jìn)行測試。固體樣品應(yīng)至少有一個(gè)平面。其他形狀和物理狀態(tài)的樣品應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。4.3.2 應(yīng)考慮試驗(yàn)樣品的無菌性。4.3.2.1 無菌器械試驗(yàn)材料的試驗(yàn)全過程應(yīng)按無菌操作法進(jìn)行。4.3.2.2 試驗(yàn)材料如取自通常在使用前滅菌的器械，應(yīng)按照制造商提供的方法滅菌，并且試驗(yàn)全過程應(yīng)按無菌操作法進(jìn)行。用于試驗(yàn)系統(tǒng)之前，制備試驗(yàn)材料時(shí)應(yīng)考慮滅菌方法或滅菌劑對(duì)器械的影響。4.3.2.3 試撞材料如取自使用中不需要滅菌的器械，則應(yīng)在供應(yīng)狀態(tài)下使用，但在試驗(yàn)全過程中應(yīng)按無菌操作法進(jìn)行。4.3.3 對(duì)液體進(jìn)行試驗(yàn)應(yīng)：a）直接附著；或b）附著到具有生物惰性和吸收性的基質(zhì)上。注：濾膜是適用的基質(zhì)。4.3.4 對(duì)高吸收性材料，如果可能，試驗(yàn)前應(yīng)用培養(yǎng)基將其浸透，以防吸收試驗(yàn)器皿中的培養(yǎng)基。5 細(xì)胞系5.1 優(yōu)先采用已建立的細(xì)胞系并應(yīng)從認(rèn)可的貯源獲取3）5.2 在需要特殊敏感性時(shí)，只能使用直接由活體組織獲取的原代細(xì)胞、細(xì)胞系和器官型培養(yǎng)物，但需證明其反應(yīng)的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。5.3 細(xì)胞系原種培養(yǎng)貯存時(shí)，應(yīng)放在相應(yīng)培養(yǎng)基內(nèi)，在-80或-80以下凍存，培養(yǎng)基內(nèi)加有細(xì)胞保護(hù)劑，如二甲基亞砜或甘油等，長期貯存（幾月至幾年）只能在-130或-130以下凍存。5.4 試驗(yàn)應(yīng)使用無支原體污染細(xì)胞，使用前采用可靠方法檢測是否存在支原體污染。6 培養(yǎng)基6.1 培養(yǎng)基應(yīng)無菌。6.2 含血清或無血清培養(yǎng)基應(yīng)符合選定細(xì)胞系的生長要求。注：培養(yǎng)基中允許含有對(duì)試驗(yàn)無不利影響的抗生素。培養(yǎng)基的穩(wěn)定性與其成分和貯存條件有關(guān)。含谷氨酰胺和血清的培養(yǎng)基在28條件下貯存不超過一周，含谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基在28條件下貯存不超過2周。6.3 培養(yǎng)基的pH 值應(yīng)為7. 27. 4。7 細(xì)胞原種培養(yǎng)制備7.1 用選定的細(xì)胞系和培養(yǎng)基制備試驗(yàn)所需足夠的細(xì)胞。使用凍存細(xì)胞時(shí)，如加有細(xì)胞保護(hù)劑應(yīng)除去，使用前至少傳代培養(yǎng)一次。7.2 取出細(xì)胞，用適宜的酶分散法和或機(jī)械分散法制備成細(xì)胞懸浮液。3） 推薦的細(xì)胞系如CCL1（NCTC clone 929），CCL 163（Balb/3T3 clone A31）、CCL171（MRC-5）、CCL 75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10BHK-21(C-l3) 和V-79 379A。這一信息只是為本部分的使用者提供方便，但I(xiàn)SO 對(duì)使用該產(chǎn)品不提供擔(dān)保。也可使用其他能得出相同或更佳結(jié)果的細(xì)胞系。8 試驗(yàn)步驟8.1 平行樣數(shù)至少采用三個(gè)平行試驗(yàn)樣品數(shù)和對(duì)照數(shù)。8.2 浸提液試驗(yàn)8.2.1 該試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評(píng)價(jià)。8.2.2 從持續(xù)攪拌的細(xì)胞懸浮液中吸取等量的懸浮液，注入浸提液接觸的每只培養(yǎng)器皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)器皿使細(xì)胞均勻地分散在器皿的表面。8.2.3 根據(jù)培養(yǎng)基選擇含或不含5%（體幟分?jǐn)?shù)）二氧化碳的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在37士2 溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)應(yīng)在近匯合單層細(xì)胞或新鮮懸浮細(xì)胞上進(jìn)行。如僅是檢測克隆形成，應(yīng)采用較低的細(xì)胞密度。8.2.4 試驗(yàn)前用顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)情況。8.2.5 試驗(yàn)可選用：a ) 浸提原液；和b ) 以培養(yǎng)基作稀釋劑的系列浸提稀釋液。試驗(yàn)如果用單層細(xì)胞，應(yīng)棄去培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基，在每只器皿內(nèi)加等量浸提液或上述稀釋液。如用懸浮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，細(xì)胞懸浮液制備好后立即將浸提液或上述稀稀釋液加到每只平行器皿中。8.2.6 采用水等非生理浸提液時(shí)，浸提液用培養(yǎng)基稀稀后應(yīng)在最高生理相容濃度下試驗(yàn)。注：建議在稀釋浸提液時(shí)使用濃縮的（如2倍、5倍）培養(yǎng)基。8.2.7 加等量的空白試劑和陰性及陽性對(duì)照液至其他平行器血中。注：如需要，還可以用新新鮮培養(yǎng)基做對(duì)照試驗(yàn)。8.2.8 器皿按8. 2.3 中所述同樣條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應(yīng)符合選定方法的要求。8.2.9 經(jīng)過至少24 h 的培養(yǎng)后，接8. 5 確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。8.3 直接接觸試驗(yàn)8.3.1 該試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評(píng)價(jià)。8.3.2 從持續(xù)攪拌的細(xì)胞懸液中吸取等量的懸浮液，注入與試驗(yàn)樣品直接接觸的每只器皿內(nèi)。輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)器皿，使細(xì)胞均勻地分散在每只器皿的表面。8.3.3 根據(jù)培養(yǎng)基選擇含或不含5% （體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在372溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)細(xì)胞生長至近匯合。8.3.4 試驗(yàn)前用顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)情況。8.3.5 棄去培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基，加新鮮培養(yǎng)基至各器皿內(nèi)。8.3.6 在每只器皿中央部位的細(xì)胞層上各輕輕放置一個(gè)試驗(yàn)樣品，應(yīng)確保樣品覆蓋細(xì)胞層表面約十分之操作時(shí)應(yīng)注意防止樣品不必耍的移動(dòng)，否則可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的物理性損傷，這可從被移動(dòng)細(xì)胞的碎片來判斷。 注：如可能，在細(xì)胞加入前將樣品放入培養(yǎng)器皿內(nèi)。8.3.7 同法制備陰性和陽性對(duì)照材料平行器皿。8.3.8 器皿按8.3.3中所述同樣條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間（最少24h）應(yīng)符合選定方法的要求。8.3.9 去除上層培養(yǎng)基，接8.5確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。8.4 間接接觸試驗(yàn)8.4.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)8.4.1.1 該試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性評(píng)價(jià)，該方法不適用于不能通過瓊脂層擴(kuò)散的可瀝濾物或與瓊脂反應(yīng)的物質(zhì)。8.4.1.2 從持續(xù)攪樣的細(xì)跑懸浮液中吸取等量的懸浮液，注入每只試驗(yàn)用平行器皿內(nèi)。輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)器皿使細(xì)胞均勻地分散在每只器皿的表面。8.4.1.3 根據(jù)培養(yǎng)基選擇含或不含5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在372溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，直至對(duì)數(shù)生長期末細(xì)胞近匯合。8.4.1.4 試驗(yàn)前用顯微檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)情況。8.4.1.5 棄去器皿中的培養(yǎng)基，然后將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養(yǎng)基混合，使瓊脂最終質(zhì)量濃度為0.5%2%，每只器皿內(nèi)加入等量的該混合液。只能使用適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長的瓊脂。該混合瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)為液態(tài)，溫度應(yīng)適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。注：各種不同分子量和純度的瓊脂可通用。8.4.1.6 將試驗(yàn)樣品輕輕放在每只器血的固化瓊脂層上，樣品應(yīng)覆蓋細(xì)胞層表面約十分之一。吸水性材料置于瓊脂之前先用培養(yǎng)基進(jìn)行濕化處理，以防止瓊脂脫水。8.4.1.7 同法制備陰性對(duì)照和陽性對(duì)照樣品器皿。8.4.1.8 按8.4.1.3 中所述的同樣條件培養(yǎng)24 h 72 h.8.4.1.9 從瓊脂上小心地取下樣品之前、之后檢測細(xì)胞毒性.。用活體染色劑如中性紅可有助于檢測細(xì)胞毒性?；铙w染色劑可在培養(yǎng)前或培養(yǎng)后與樣品一起加入如在培養(yǎng)前加，應(yīng)在避光條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以防因染色劑光活化作用而引起細(xì)胞損傷。8.4.2 濾膜擴(kuò)散試驗(yàn)8.4.2.1 該試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性評(píng)價(jià)。8.4.2.2 在數(shù)只試驗(yàn)用培養(yǎng)皿內(nèi)，各放置一枚孔徑0.45 m、無表面活性劑的濾膜，并加入等量持續(xù)攪拌的細(xì)胞懸浮液，輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻地分散在每只濾膜的表面。8.4.2.3 根據(jù)培養(yǎng)基選擇含或不含5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在372溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，直至對(duì)數(shù)生長期末細(xì)胞近匯合。8.4.2.4 試撿前用顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)情況。8.4.2.5 棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，將濾膜細(xì)胞面向下放在固化的瓊脂層上（見8.4.1.6）。8.4.2.6 輕經(jīng)將試驗(yàn)樣品放到濾膜無細(xì)胞面的上面濾膜上放置不產(chǎn)生反應(yīng)的環(huán)，用以保留提取液和新加入的成分。8.4.2.7 同法制備陰性和陽性對(duì)照樣品濾膜。8.4.2.8 按8.4.2.3所述方法培養(yǎng)2h 10 min。8.4.2.9 輕輕從濾膜上取下樣品，并從瓊脂面上小心分離開濾膜。8.4.2.10 采用合適的染色程序確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。8.5 細(xì)胞毒性判定8.5.1 可來用定性或定量方法檢測細(xì)胞毒性。a）定性評(píng)價(jià)：用顯微鏡檢查細(xì)胞（如果需耍，使用細(xì)胞化學(xué)染色）評(píng)價(jià)諸如一般形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和膜完整性等方面的變化，一般形態(tài)的改變可描述性地在試驗(yàn)報(bào)告中記錄或以數(shù)字記錄，以下是給試驗(yàn)材料計(jì)分的有效方法。細(xì)胞需性計(jì)分 含義0 無細(xì)胞毒性1 輕微細(xì)胞毒性2 中度細(xì)胞毒性3 重度細(xì)胞毒性試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)包括評(píng)價(jià)方法和評(píng)價(jià)結(jié)果。b）定量評(píng)價(jià)：測定細(xì)胞死亡、細(xì)胞生長抑制、細(xì)胞繁殖或細(xì)胞克隆形成?？梢杂每陀^的方法對(duì)細(xì)胞數(shù)量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放和還原或其他可測定參數(shù)進(jìn)行定量測試，使用的方法和測試結(jié)果應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中記錄。注：一些檢測細(xì)胞毒性的特殊方法，可能需要零點(diǎn)或基線細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照。8.5.2 應(yīng)慎重選擇評(píng)價(jià)方法，試驗(yàn)樣品如果釋放對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)或?qū)z測有影響的物質(zhì)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果可能無效。注：評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，釋