升麻炮制前后有效成分的比較研究.doc

升麻炮制前后有效成分的比較研究 周保琪 2009級(jí)中藥傳承班 河南中醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450008摘要 目的:建立測定升麻中有效成分阿魏酸和異阿魏酸含量的方法,并比較炮制前后阿魏酸、異阿魏酸和272脫氧升麻亭的含量差異。方法:阿魏酸和異阿魏酸測定方法:色譜柱為YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150 mm, 5m) ,乙腈2水2乙酸(15 85 0. 25)為流動(dòng)相,流速0. 6 mL /min,柱溫26 C,紫外檢測波長320 nm; 272脫氧升麻亭測定方法:色譜柱為YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150 mm, 5m) ,乙腈2水2乙酸(40 60 1)為流動(dòng)相,流速0. 6 mL /min,柱溫26 C,示差檢測器。結(jié)果:測定阿魏酸線性范圍( r) ,加樣回收率為(RSD ) ;異阿魏酸線性范圍( r ) ,加樣回收率為 (RSD ) 。結(jié)論該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,適合于升麻藥材和飲片的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞 升麻; 阿魏酸; 異阿魏酸; 272脫氧升麻亭; 炮制升麻為常用中藥,具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽氣等功能, 2010年版中國藥典收載其原植物有大三葉升麻Cim icifuga heracleifolia Kom. 、興安升麻C. dahuricaMaxim. 和升麻C. foetida L. 3種。升麻根莖主要含三萜皂苷、有機(jī)酸和色原酮類化合物。一般認(rèn)為升麻有機(jī)酸是其有效成分,并以所含的阿魏酸、異阿魏酸為指標(biāo)控制質(zhì)量 14 。近年來研究發(fā)現(xiàn)升麻所含的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷具有抗腫瘤、抑制核苷運(yùn)轉(zhuǎn)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種生理活性,也是其活性成分之一。升麻的臨床應(yīng)用以生片和蜜制片為主,有關(guān)升麻炮制研究非常少,本實(shí)驗(yàn)將以RP2HPLC法對升麻炮制前后有效成分阿魏酸、異阿魏酸和三萜皂苷272脫氧升麻亭(272deoxyactein)的含量進(jìn)行測定,并探討升麻炮制前后有效成分變化規(guī)律。1升麻炮制前后阿魏酸和異阿魏酸的含量測定1. 1儀器與試藥日本Jasco 系列HPLC 色譜儀: Jasco pump21580, Jasco UV21575 檢測器, Jasco 工作站; 湘儀天平廠生產(chǎn)TG332A微量分析天平,昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)KQ2250B型超聲波振動(dòng)儀。乙腈色譜純( Fisher公司出品) ,重蒸餾水自制,阿魏酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)077329910) ,異阿魏酸和272脫氧升麻亭為本課題組分離和結(jié)構(gòu)鑒定, 經(jīng)HPLC 法檢測含量達(dá)98 。1. 2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1色譜條件色譜柱為YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150mm, 5m) ;乙腈2水2乙酸(15 85 0. 25)為流動(dòng)相,流速0. 6 mL /min,柱溫26 C, 紫外檢測波長320nm,進(jìn)樣量20L,外標(biāo)法定量。理論塔板數(shù)按阿酸峰計(jì)算,應(yīng)不低于4 000。1. 2. 2溶液制備對照品溶液制備準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的對照品阿魏酸2. 12 mg置2 mL 量瓶中,用80 甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即得1. 06 mg/mL 阿魏酸貯備溶液;另再準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的對照品異阿魏酸2. 08 mg置2 mL 量瓶中,用80 甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即得1. 04 mg/mL 異阿魏酸貯備溶液。供試品溶液的制備精密稱取干燥的升麻樣品粉末0. 5 g,置三角瓶中,加入50 mL甲醇,搖勻,于80 C水浴上回流提取40min,過濾,濾渣用20 mL甲醇洗滌3次,合并濾液,回收甲醇,提取物用80甲醇定容至2 mL量瓶,搖勻,即得。1. 2. 3測定法精密吸取阿魏酸和異阿魏酸貯備液80 L 和160L置2 mL量瓶,用80 甲醇定容至刻度,即為阿魏酸和異阿魏酸稀釋溶液。用微量進(jìn)樣器精密吸取供試品溶液和對照品稀釋溶液各20 L 注入HPLC儀,外標(biāo)法定量，得到對照品、樣品HPLC色譜圖,測定結(jié)果見表1。表1升麻炮制前后有效成分含量測定藥名 產(chǎn)地 類別 阿魏酸含量 異阿魏酸含量 27脫氧升麻亭含量 （g） (g） (g） 升 甘肅 生藥 切片 蜜制片麻 四川開源 生藥 切片 蜜制片 興安升麻炮制前后有效成分含量測定藥名 產(chǎn)地 類別 阿魏酸含量 異阿魏酸含量 27脫氧升麻亭含量 （g） (g） (g） 興 內(nèi)蒙 生藥 安 切片升 蜜制片麻 牡丹江 生藥 切片 蜜制片 河北承德 生藥 切片 蜜制片1. 3方法學(xué)考察1. 3. 1穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液按上述色譜條件分別于0,1, 2, 4, 6, 10 h進(jìn)樣測定,預(yù)測結(jié)果表明含量在10 h內(nèi)基本不變。1. 3. 2線性關(guān)系考察分別精密吸取阿魏酸貯備溶液20, 40, 80, 120,160L置1 mL量瓶,加80 甲醇稀釋至刻度,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理,得阿魏酸線性回歸方程 , r,線性范圍;另精密吸取異阿魏酸貯備液20, 40, 60,80, 100L置1 mL量瓶,加80 甲醇稀釋至刻度,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理,得異阿魏酸線性回歸方程 , r ,線性范圍。1. 3. 3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批藥材5份,按供試液制備并測定。計(jì)算結(jié)果阿魏酸和異阿魏酸的RSD 。1. 3. 4精密度試驗(yàn)取阿魏酸和異阿魏酸貯備液各40L 置1 mL量瓶,加80 甲醇稀釋至刻度,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析,連續(xù)測定5次,每次進(jìn)樣20L,計(jì)算阿魏酸峰面積的RSD , 異阿魏酸RSD 。1. 3. 5回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量生藥樣品(四川開源產(chǎn))約0. 25 g共5份,分別加入阿魏酸(1. 02 mg/mL)和異阿魏酸( 1. 05 mg/mL)對照品溶液40, 80 L,待溶劑揮干后,按供試液制備并測定。取5次測定的平均值計(jì)算回收率( n = 5) ,計(jì)算結(jié)果阿魏酸和異阿魏酸加樣回收率(RSD ) 。2升麻炮制前后272脫氧升麻亭的含量測定2. 1儀器與試藥日本Jasco 系列HPLC 色譜儀: Jasco pump21580, Jasco Ri21575示差檢測器, Jasco工作站;湘儀天平廠生產(chǎn)TG332A微量分析天平,昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)KQ2250B型超聲波振動(dòng)儀。乙腈色譜純( Fisher公司出品) ,水為重蒸餾水,對照品272脫氧升麻亭由作者分離,經(jīng)紅外、質(zhì)譜和核磁共振鑒定結(jié)構(gòu), HPLC法進(jìn)行純度檢查,面積歸一法大于98 。升麻樣品由作者采集并鑒定學(xué)名。2. 2方法2. 2. 1色譜條件色譜柱為YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150mm, 5m) ;乙腈2水2乙酸(40 60 1)為流動(dòng)相,流速0. 6 mL /min,柱溫26 C,示差檢測器,進(jìn)樣量20L,外標(biāo)法定量。理論塔板數(shù)按272脫氧升麻峰亭計(jì)算,應(yīng)不低于3 500。2. 2. 2試液的制備供試液制備精密稱取樣品粉末2 g,置磨口圓底瓶中,加入甲醇80 mL 于水浴中加熱回流,提取60 min,濾出提取液,殘?jiān)ㄔ偬崛?次,將濾液合并,回收溶劑。將此提取物以甲醇(色譜純)溶解,并定容至5 mL 量瓶,搖勻,即得。過0. 45 m的微孔濾膜,作供試品溶液。對照品溶液制備精密稱取干燥至恒重對照品2. 07 mg置2 mL 量瓶,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻即得1. 035 mg/mL對照品溶液。2. 2. 3樣品測定精密吸取對照品溶液10, 20L和供試品溶液20L,分別注入HPLC儀,外標(biāo)法定量對，得到照品、樣品HPLC色譜圖。測定結(jié)果見表1。3討論3. 1檢測波長和檢測器的確定對阿魏酸和異阿魏酸甲醇溶液在200400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描,阿魏酸和異阿魏酸的最大吸收波長分別為313和320 nm,故選擇320 nm作檢測波長。由于272deoxyactein無紫外吸收,只能用示差或蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行測定,本研究選擇示差檢測器。3. 2供試液制備方法的確定測定阿魏酸和異阿魏酸的含量時(shí),考察了不同提取溶劑(甲醇、50 甲醇和水) 、不同提取方法(超聲波提取和加熱回流提取)及不同提取次數(shù),預(yù)測結(jié)果表明,以甲醇作溶劑,加熱回流提取阿魏酸和異阿魏酸的含量較高。3. 3升麻炮制后阿魏酸和異阿魏酸變化的探討預(yù)測結(jié)果：升麻切制和蜜制以后,阿魏酸和異阿魏酸含量均有所增高,且蜜制片比切片含量增加更多。從HPLC色譜圖上,可看出升麻炮制前后色譜圖差異較大,有些色譜峰面積增大,而有些色譜峰面積減小。我們在作升麻化學(xué)成分研究時(shí),發(fā)現(xiàn)升麻酚酸類化合物多以酸酯的形式存在,可能在炮制過程中,其酸酯類成分水解生成有機(jī)酸和醇類,使阿魏酸和異阿魏酸含量增加。3. 4升麻炮制后272脫氧升麻亭變化的探討預(yù)測結(jié)果：升麻炮制前后272deoxyactein的含量略有降低,可能是炮制后,樣品中含有一定量的蜂蜜,使272de2oxyactein的含量相對降低,但炮制前后的色譜指紋圖無變化,說明升麻炮制對其三萜類成分影響不大。預(yù)測結(jié)論：該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,適合于升麻藥材和飲片的質(zhì)量控制參考文獻(xiàn) 1 中國藥典2010年版一部 S. 2010: 50. 2 潘