呼吸道聯(lián)檢操作規(guī)程--SOP資料.doc

_醫(yī)院檢驗(yàn)科操作標(biāo)準(zhǔn)程序文件文件編號(hào): HDHY-MYJY-P009-2007版 序：第 2 版 第 1 次修訂生效日期: 2007年1月1日責(zé)任科室: _頁(yè) 碼: 第1頁(yè) 共 2頁(yè)_醫(yī)院檢驗(yàn)科_室（SOP）文件撰 寫(xiě) 人： 審 核 人： 批 準(zhǔn) 人： 批準(zhǔn)日期： 2007年 7月31日啟用日期： 2007年 8月 1 日二零零七年七月一日制批 準(zhǔn) 頁(yè)根據(jù)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(2006年,第三版)，化學(xué)放光儀 （Anthos lucy）, 洗板機(jī)（Anthos fluido）使用說(shuō)明書(shū)；免疫檢驗(yàn)有關(guān)試劑盒、質(zhì)控品的使用操作說(shuō)明書(shū)；消毒技術(shù)規(guī)范以及醫(yī)院內(nèi)部有關(guān)管理制度、生物安全制度的規(guī)定和要求，臨床免疫檢驗(yàn)操作規(guī)程文件NO.2版經(jīng)實(shí)際運(yùn)行，現(xiàn)予以批準(zhǔn)通過(guò)，于 2007年 8月 1日起生效并開(kāi)始實(shí)施。免疫室和檢驗(yàn)科有關(guān)工作人員必須認(rèn)真學(xué)習(xí)，嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行。（NO.2版依據(jù)檢驗(yàn)技術(shù)和我科工作發(fā)展及管理工作的需求進(jìn)行的補(bǔ)充完善和改進(jìn)另行通知）。任何個(gè)人不得更改，實(shí)際工作中如發(fā)現(xiàn)不妥之處，請(qǐng)按程序以文字形式向?qū)徍巳藚R報(bào)；在未經(jīng)批準(zhǔn)人同意/批準(zhǔn)新文件之前，仍執(zhí)行此文。_醫(yī)院檢驗(yàn)科2007年7月31日呼吸道九聯(lián)檢操作規(guī)程1. 項(xiàng)目中文名稱：九項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM抗體檢測(cè)（間接免疫熒光法）項(xiàng)目英文名稱：PNEUMOSLIDE IgM2.實(shí)驗(yàn)原理與方法：2.1 原理：間接免疫熒光法（IFA）是基于待測(cè)樣本中的抗體與吸附在載玻片上的抗原發(fā)生的反應(yīng)。樣本中存在的特異性抗體和抗原反應(yīng)，未與抗原結(jié)合的免疫球蛋白在洗滌步驟中除去。在下一步驟中，抗原-抗體復(fù)合物與熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白反應(yīng)。用免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果。2.2 方法：間接免疫熒光法3.設(shè)備性能參數(shù)：4.標(biāo)本的要求：需由專業(yè)人員無(wú)菌靜脈穿刺采集血液。使用消毒或無(wú)菌技術(shù)能保持樣本的完整性。血清樣本采集后如不在8小時(shí)內(nèi)檢測(cè)應(yīng)28 C冷藏，如7天內(nèi)不檢測(cè)，則應(yīng)冷凍（-20C）保存。不要反復(fù)凍融以防止免疫球蛋白滴度降低，特別是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若樣本中含有微粒要離心使之澄清。4.儀器：熒光顯微鏡5.試劑廠家及名稱：西班牙VIRCELL公司6.操作步驟：1. 使用前，將所有試劑平衡至室溫。載玻片平衡至室溫后再打開(kāi)。2. 樣本的稀釋：按1:1比例稀釋血清樣本，即25L血清加入25L PBS2中。陰陽(yáng)性對(duì)照3 4不需要稀釋。3. 用抗人IgG吸附劑7 處理稀釋后的血清：將30L稀釋后的血清加入150L吸附劑中，徹底混勻。陰陽(yáng)性對(duì)照3 和4 不需吸附劑處理。處理后的血清要離心10-15分鐘除去沉淀，以防干擾檢測(cè)。4. 在載玻片1 的每孔中加15L吸附劑處理過(guò)的血清（一份樣本對(duì)應(yīng)一個(gè)載玻片）。在一個(gè)載玻片的每孔中加入15L不稀釋的陽(yáng)性對(duì)照3，在另一個(gè)載玻片的每孔中加入15L不稀釋的陰性對(duì)照4。5. 將載玻片放入濕盒中，37溫育90分鐘。6. 用PBS 2 的緩慢水流沖洗載玻片1（避免直接沖入孔內(nèi)）后，浸泡在PBS中并放置在水平搖床上輕輕搖動(dòng)10分鐘。再用蒸餾水緩慢水流沖洗（避免直接沖入孔內(nèi)）。7. 載玻片1 自然晾干。8. 每孔加入15L抗人IgM FITC結(jié)合物溶液5M（不需稀釋）。9. 將載玻片放入濕盒，37溫育30分鐘。10. 重復(fù)6和7的洗滌步驟。11. 加幾小滴封閉介質(zhì)6，小心蓋上蓋玻片。12. 盡快用熒光顯微鏡在400倍放大率下觀察結(jié)果。如果不能立即觀察，可將其避光放置于2-8C不超過(guò)24小時(shí)。* 簡(jiǎn)明操作程序（將風(fēng)干改成晾干）7. 有效性判斷每一次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以確認(rèn)試驗(yàn)和試劑盒的有效性。觀察到的熒光模式應(yīng)為：陽(yáng)性對(duì)照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控的1-15%細(xì)胞出現(xiàn)蘋(píng)果綠細(xì)胞核、胞漿或胞膜熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時(shí)觀察到著色的合胞）；軍團(tuán)菌、衣原體或立克次體中所有的細(xì)菌呈現(xiàn)出蘋(píng)果綠熒光；支原體對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋(píng)果綠色熒光。陰性對(duì)照：軍團(tuán)菌、肺炎衣原體和立克次體無(wú)熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。8.樣本結(jié)果判斷陽(yáng)性結(jié)果：可以觀察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對(duì)陽(yáng)性血清的1-15%細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋(píng)果綠色熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時(shí)觀察到著色的合胞）；軍團(tuán)菌、衣原體或立克次體中所有的細(xì)菌呈現(xiàn)出蘋(píng)果綠色熒光；支原體對(duì)陽(yáng)性血清在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋(píng)果綠色熒光。陰性結(jié)果：可觀察到軍團(tuán)菌、肺炎衣原體和立克次體無(wú)熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。9.檢驗(yàn)結(jié)果的解釋1. 每一批產(chǎn)品在放行前都要經(jīng)過(guò)更加嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)量控制（Q.C.）的檢驗(yàn)。質(zhì)控品可溯源到經(jīng)過(guò)內(nèi)部確認(rèn)的參考血清盤(pán)。2. 如果所有細(xì)胞或第10孔出現(xiàn)熒光表明存在抗核或抗細(xì)胞抗體，不能判為陽(yáng)性，應(yīng)用其他方法進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)質(zhì)控孔中無(wú)熒光時(shí)一定要查明病因。3. 由于非軍團(tuán)菌感染的病人中經(jīng)常出現(xiàn)交叉抗體，軍團(tuán)菌陽(yáng)性結(jié)果需結(jié)合臨床癥狀綜合評(píng)價(jià)。建議做較高稀釋度的檢測(cè)來(lái)提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。4. 與說(shuō)明書(shū)中所列結(jié)果不同不能判為陽(yáng)性。5. 在初次感染和再次感染的過(guò)程中，IgG和IgM抗體有不同的表現(xiàn)方式：初次感染時(shí)，幾乎在所有的情況下IgM和IgG均出現(xiàn)（IgM早于IgG出現(xiàn)）；而再次感染時(shí)可能不出現(xiàn)IgM，因此IgG的檢測(cè)是唯一有用的診斷方法。在許多疾病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM一般情況下僅在感染后23個(gè)月存在于血清中，因此是近期感染的一個(gè)有效標(biāo)志物。6. 九種病原體IgM抗體陰性及陽(yáng)性結(jié)果的熒光染色圖譜： 陽(yáng)性結(jié)果圖譜：陰性結(jié)果圖譜：10.檢驗(yàn)方法的局限性1. 本試劑盒用于檢測(cè)人血清。2. 建議用戶仔細(xì)閱讀和理解說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按照程序進(jìn)行操作才能獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果。特別是樣本和試劑的正確吸取以及仔細(xì)的洗板、溫育的時(shí)間控制對(duì)獲得準(zhǔn)確結(jié)果都很重要。3. 樣本的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與臨床評(píng)價(jià)以及其他診斷方法結(jié)合使用。4. 本檢測(cè)不能指出感染部位，不能單獨(dú)使用。5. 抗體水平無(wú)顯著上升時(shí)不能排除感染的可能性。6. 在感染早期采集的樣本可能檢測(cè)不到IgG，在這種情況下建議采用IgM檢測(cè)，或者在14-21天后采集第二個(gè)血清樣本，并與原標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)來(lái)確定是否發(fā)生血清轉(zhuǎn)換。7. 嬰兒的IgG檢測(cè)結(jié)果要作謹(jǐn)慎解釋，因?yàn)槌錾澳阁w的IgG被動(dòng)的傳遞給了胎兒。對(duì)6個(gè)月以下的嬰兒IgM檢測(cè)是更為有用感染標(biāo)志物。8. 單一樣本抗體檢測(cè)結(jié)果不能幫助作出近期感染的診斷。應(yīng)采集雙份樣本（急性期和康復(fù)期）同時(shí)檢測(cè)來(lái)觀察血清轉(zhuǎn)化或抗體水平的明顯升高。9. 對(duì)患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA檢測(cè)時(shí)，支原體、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，會(huì)在細(xì)胞上發(fā)生非特異性反應(yīng)，這些血清不能用本方法評(píng)價(jià)。質(zhì)控孔用于檢測(cè)這種現(xiàn)象。在嗜肺軍團(tuán)菌和Q熱立克次體中，有時(shí)血清會(huì)含有與卵抗原反應(yīng)的抗體，所以使用卵黃囊固定抗原會(huì)出現(xiàn)非特異性熒光。當(dāng)出現(xiàn)這種情況時(shí)，該血清就不能用IFA進(jìn)行分析了。10. 未對(duì)本檢測(cè)在療效隨訪方面的性能做過(guò)評(píng)估。11. 除了肺炎外，未對(duì)本技術(shù)在肺炎衣原體引起的其他疾病方面的性能作過(guò)評(píng)估。11.產(chǎn)品性能指標(biāo)1. 靈敏度和特異性嗜肺軍團(tuán)菌血清1型：與另一個(gè)商品化的IFA試劑盒對(duì)照檢測(cè)82份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 8294.4%98.4%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。肺炎支原體：與一種ELISA試劑盒對(duì)照檢測(cè)62份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 6296.8%100.0%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。Q熱立克次體：與另一個(gè)商品化的IFA試劑盒對(duì)照檢測(cè)74份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 74100.0%97.6%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。肺炎衣原體：與另一個(gè)商品化的IFA試劑盒對(duì)照檢測(cè)61份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 61100.0%980%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。腺病毒：與一種ELISA試劑盒對(duì)照檢測(cè)74份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 7485.7%97.0%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。呼吸道合胞病毒：與一種ELISA試劑盒對(duì)照檢測(cè)97份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 9793.8%100.0%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。甲型流感病毒：與一種ELISA試劑盒對(duì)照檢測(cè)46份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 4694.1%96.4%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。乙型流感病毒：與一種ELISA試劑盒對(duì)照檢測(cè)40份血清樣本，結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 40100.0%96.4%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。副流感病毒1、2和3型：與一種ELISA試劑盒對(duì)照檢測(cè)36份血清樣本。結(jié)果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 36100.0%96.3%有非特異性反應(yīng)的的血清從最終計(jì)算中刪除。2. 精密度分析內(nèi)精密度：在相同實(shí)驗(yàn)條件下由同一個(gè)操作人員在同一次試驗(yàn)中對(duì)3份血清（2份陽(yáng)性和1份陰性）分別進(jìn)行5組加樣檢測(cè)。結(jié)果：滴度變化不超過(guò)一個(gè)稀釋度。分析間精密度：在5種不同條件下（不同操作人員或不同試驗(yàn)日期）對(duì)3份血清（2份陽(yáng)性和1份陰性）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：滴度變化不超過(guò)一個(gè)稀釋度。3. 交叉反應(yīng)和干擾嗜肺軍團(tuán)菌血清1型：檢測(cè)20份細(xì)菌綜合病癥組（肺炎支原體、肺炎衣原體和Q熱立克次體）、革蘭氏陰性細(xì)菌（布魯氏菌，沙門(mén)氏菌）和抗核抗體陽(yáng)性血清樣本。肺炎支原體：檢測(cè)12份細(xì)菌綜合病癥組（嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體和Q熱立克次體）陽(yáng)性血清樣本。Q熱立克次體：檢測(cè)20份細(xì)菌綜合病癥組（肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團(tuán)菌）、同種屬的細(xì)菌（發(fā)疹傷寒等的病原體）和抗核抗體陽(yáng)性血清樣本。肺炎衣原體：檢測(cè)20份細(xì)菌綜合病癥組（嗜肺軍團(tuán)菌、Q熱立克次體和肺炎支原體），同種屬的細(xì)菌（發(fā)疹傷寒等的病原體）和抗核抗體陽(yáng)性血清樣本。腺病毒：檢測(cè)8份病毒綜合病癥組（RSV、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）陽(yáng)性血清樣本。呼吸道合胞病毒：檢測(cè)10份病毒綜合病癥組（腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）或根據(jù)病毒分類(lèi)（麻疹）陽(yáng)性血清樣本。甲型流感病毒：檢測(cè)8份病毒綜合病癥組（RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）陽(yáng)性的血清樣本。乙型流感病毒：檢測(cè)8份病毒綜合病癥組（RSV、甲型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）陽(yáng)性血清樣本。副流感病毒血清1、2和3型：檢測(cè)8份病毒綜合病癥組（RSV、甲型和乙型流感病毒和腺病毒）陽(yáng)性血清樣本。結(jié)論：檢測(cè)結(jié)果表明本試劑盒與上述參考品無(wú)交叉反應(yīng)或干擾，從而證實(shí)了該試劑盒的特異性反應(yīng)。其它干擾研究對(duì)25份類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性血清進(jìn)行了2種病毒和2種細(xì)菌抗原IgG和 IgM 抗體的檢測(cè)。對(duì)另外兩份血清進(jìn)行了每種抗原IgG 和IgM抗體的檢測(cè)。在IgM檢測(cè)中，用抗IgG抗體對(duì)血清進(jìn)行了吸附處理。結(jié)果顯示，吸附劑可以有效避免類(lèi)風(fēng)濕因子的干擾。經(jīng)驗(yàn)證，吸附劑也可以有效地避免IgG抗體過(guò)量造成的假陰性。17.注意事項(xiàng)和安全防護(hù)措施1. 本產(chǎn)品用于體外診斷，僅限專業(yè)人員使用。2. 僅使用試劑盒內(nèi)的組分，不要混用不同試劑盒或不同廠家的試劑組分。3. 每步操作必須使用干凈吸頭，僅使用干凈的耗材，最好是一次性使用的耗材。4. 包裝如有損壞請(qǐng)勿使用。5. 切勿用嘴吸移液管加樣。6. 本試劑盒中的吸附劑、結(jié)合物和質(zhì)控血清含有動(dòng)物源性物質(zhì)，質(zhì)控血清還含有人源性物質(zhì)。盡管本試劑盒中的人血清質(zhì)控品已經(jīng)測(cè)試為HBsAg、HCV抗體和HIV抗體陰性，質(zhì)控血清和病人樣本仍應(yīng)作為潛在感染性物質(zhì)進(jìn)行處理?？變?nèi)包被的經(jīng)滅活的嗜肺軍團(tuán)菌血清1型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型，也仍應(yīng)視為具有潛在感染性并小心處置。目前沒(méi)有方法可以確保這些或其他感染性物質(zhì)不存在，因此所有的材料應(yīng)視為具有潛在感染性進(jìn)行處置，應(yīng)遵守當(dāng)?shù)仃P(guān)于臨床廢棄物處理的法規(guī)。7. 結(jié)合物、吸附劑、封閉介質(zhì)和質(zhì)控品含有疊氮鈉（濃度0.1%），避免接觸酸和重金屬。8. 封閉介質(zhì)含有甘油，請(qǐng)勿接觸酸和暴露在高溫下。9. 伊文斯藍(lán)（濃度0.1%）是一種致癌物。請(qǐng)勿接觸皮膚和眼睛。萬(wàn)一接觸到該溶液，用水徹底沖洗并到醫(yī)院檢查。10. 僅按本說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，不遵守規(guī)定的溫育時(shí)間和溫度會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。11. 載玻片上病人樣本交叉污染會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果，要小心操作防止發(fā)生。12. 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、光源條件和類(lèi)型會(huì)影響熒光質(zhì)量。13. 不要將試劑不必要地放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間。14. 每個(gè)載玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用沒(méi)有用過(guò)的孔。15. 試劑盒里的玻璃組分破碎時(shí)可能傷及身體，小心處理。16. 吸附劑加入樣本后要注意觀察是否有明顯的沉淀出現(xiàn)。18. 標(biāo)簽符號(hào)：體外診斷用醫(yī)療器械使用有效期 8C2C 儲(chǔ)存條件 2-8C xx可用于檢測(cè)的次數(shù)（規(guī)格）批號(hào)目錄號(hào)使用說(shuō)明書(shū)每個(gè)載玻片上反應(yīng)孔的數(shù)量19.參考文獻(xiàn)1. 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