人參皂甙Rh2致MCF7ADM凋亡和逆轉MCF7ADM多藥耐藥性的基礎.doc

人參皂貳Rh2致MCF一7/ADM凋亡和逆轉MCF一7/ADM多藥耐藥性的基礎研究摘要第一部分:乳腺癌耐藥細胞株體外模型的建立及其耐藥機理研究腫瘤細胞的多藥耐藥性 (Multidrugresistanee，MDR)是指腫瘤細胞接觸一種抗癌藥物產生耐藥的同時，對其它結構和作用機理不同的抗癌藥物亦產生交叉耐藥。MDR的原因是復雜的，但MDRI基因過度表達產生的p一糖蛋白 (permeabilityglyeoprotein，p一gp)是MnR產生的最重要原因。本實驗擬針對P一gP介導的多藥耐藥現(xiàn)象，建立人乳腺癌細胞系MCF一7的耐藥細胞株，以便為探討乳腺癌細胞MDR的發(fā)生機制，并探尋逆轉MDR的有效方法和藥物提供理想的體外實驗模型。方法:通過阿霉素濃度梯度誘導法逐步培養(yǎng)出MCF一7的耐藥細胞株MCF一7/ADM。MTT法測定并比較阿霉素(ADM)對MCF一7細胞和MCF一 7/ADM細胞的ICS。;通過羅丹明123滯留實驗比較MCF一7細胞和MCF一7/ADM細胞內羅丹明123熒光強度的差別;RT-PCR和流式細胞儀比較MCF一7細胞和MCF一 7/ADM細胞內 mdrlmRNA表達及P一gp表達的不同。結果:歷時6個月，成功培養(yǎng)出MCF一7的耐藥細胞株MCF一 7/ADM。MCF一 7/ADM細胞的 ADMICS。為 65.43士 3.94pM，顯著高于MCF一7細胞的 ADMICS。一 1.12士 0.14pM(P0.05)，兩者相差約58倍;培養(yǎng)體系中加入等量羅丹明123，MCF一7lADM細胞羅丹明123熒光強度為(1.22士0.20)%，顯著低于MCF一7細胞羅丹明123熒光強度(97.67土1.01)%(P0，05)，兩者相差約80倍;RT.PCR法顯示出MCF一 7/ADM細胞內 mdrlmRNA高表達，MCF一7細胞內 mdrimRNA沒有表達;流式細胞儀測定MCF一7lADM細胞內P一gp表達為99.80%，而MCF一7細胞內P一gP表達為53.70%，兩者相比有顯著差異。結論:MCF一7/ADM細胞具有典型的MDR現(xiàn)象，其產生MDR的機制主要為MDRI基因過度表達，導致P一gP過度表達，從而使細胞內藥物濃度減少。此耐藥細胞株的建立為進一步研究腫瘤細胞多藥耐藥的發(fā)生機制和研究逆轉耐藥方法提供了理想的實驗工具。關鍵詞:MCF一7細胞系，多藥耐藥，MDRI基因，P一糖蛋白第二部分:人參皂貳RhZ對MCF一7及MCF一7/ADM的抑制作用研究目的:近年來，人們逐漸認識到促進腫瘤細胞的凋亡是惡性腫瘤治療的新目標。大量研究表明，單味中藥的有效成分及復方制劑在誘導腫瘤細胞凋亡中可以起重要作用。人參(PanaxginsengC.A)為五加科多年生草本植物，其成分具有諸多生物活性，人參皂試助2是由人參中提取的天然活性成分。大量研究證明RhZ具有非常顯著的抗腫瘤作用，其抗腫瘤藥理作用值得深入的研究。本研究擬以人乳腺癌細胞系MCF一7為受試對象，旨在研究Rh2在抑制MCF一7和MCF一7/ADM細胞增殖方面的作用及機理。方法:不同濃度Rh:分別作用于MCF一7及MCF一7/ADM細胞，應用MTT法確定各組細胞在24小時、48小時和72小時三個時間點的增殖抑制率;通過流式細胞儀檢測RhZ對MCF一7及MCF一 7/ADM細胞壞死、凋亡和細胞周期的影響;并檢測RhZ對MCF一7及MCF一7/ADM細胞easpase3活性的影響。結果:580pmol/LRhZ可以顯著抑制MCF一7和MCF一7/ADM的增殖(P80pInol/L后細胞抑制率則不再隨燦:濃度增加而上升;RhZ對MCF一7細胞的抑制作用更強。40pmol/L助2主要通過導致MCF一7細胞壞死而抑制其增殖，壞死率為(31.9士2.55)%，凋亡率為(11.33士0.66)%，(P0.05);而相同濃度燦2作用于MCF一 7/ADM細胞，則主要是通過Caspases途徑誘導其凋亡，壞死率(7.28士0.20)%，而凋亡率達(26.49士2.42)%，(P0.05)。RhZ對兩種細胞周期的影響也有所不同:燦2使MCF一7細胞周期阻滯于S期，GZ/M期細胞減少;而在MCF一 7/ADM細胞中，變化卻相反，RhZ導致S期細胞減少，GZ/M期細胞增多。結論:人參皂貳Rh:通過不同機制抑制了MCF一7和MCF一 7/ADM細胞的增殖:RhZ主要通過導致MCF一7細胞壞死而抑制其增殖;而對于MCF一7從DM細胞，則主要是通過Caspases途徑誘導其凋亡。助:誘導耐藥細胞系MCF一7/ADM凋亡的研究結果顯示其在抗腫瘤作用方面的獨特性。關鍵詞:人參皂貳RhZ，MCF一7細胞系，凋亡，壞死，細胞周期第三部分:人參皂貳Rh:逆轉MCF一7/ADM多藥耐藥性的研究目的:惡性腫瘤對化療藥物的多藥耐藥是當今腫瘤化療失敗的主要原因，而MDRI基因過度表達產生的P一gp是多藥耐藥性產生的最重要原因，p一gp屬于ABC(ATp一 bindingCassette)轉運蛋白家族的一員，是一種能量依賴性藥物轉出泵，能將化療藥物從癌細胞內泵出細胞外，從而使藥物在細胞內積蓄濃度降低，藥物的細胞毒作用降低，導致腫瘤化療的失敗。因此，尋找低毒、有效的MDR逆轉劑是腫瘤化療領域急需解決的問題。中藥治療腫瘤不僅毒副作用小，而且作用途徑比較廣泛。近年大量研究表明，許多單味中藥的有效成分及復方制劑在體外實驗中有逆轉腫瘤細胞MDR的作用。本實驗的研究目的為:人參皂貳RhZ作為抗腫瘤作用非常顯著的中藥單體，是否具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的作用，并探尋其機理。方法:RhZ與ADM作用于MCF一7及MCF一 7/ADM細胞，72小時后，MTT法比較單獨應用ADM與ADM聯(lián)合應用助2各組 ADMIC50的變化;羅丹明123加入MCF一7及MCF一7/ADM細胞，流式細胞儀分析不同濃度Rh:和維拉帕米抑制羅丹明123外排的情況;RT.PCR法和流式細胞儀檢測Rh:對MCF一7/ADM細胞mdrlmRNA表達及P一gp表達的影響。結果:RhZ可以顯著降低MCF一7/ADM的 ADMICS。(P0.05)，40pmol/L燦:可使MCF一7/ADM的ADMICS。下降為2.14士0.26pM，耐藥倍數(shù)僅為1.91，而對MCF一7細胞的 ADMIC50卻沒有影響;助2可以增加MCF一7/ADM細胞內羅丹明123熒光表達強度(P0.05)，比維拉帕米抑制羅丹明123外排作用更強，在MCF一7細胞內燦2和維拉帕米均無此作用;RhZ對MCF一7/ADM細胞 mdrlmRNA表達及P一gp表達沒有影響。結論:體外實驗中，人參皂貳Rh:可以有效逆轉P一gp介導的MCF一7/ADM的耐藥性，是一種安全、高效的MDR逆轉劑，可能成為具有廣闊前景的抗腫瘤藥物。關鍵詞:人參皂貳RhZ，MCF一7細胞系，多藥耐藥，逆轉，MDRI基因，P一糖蛋白前言腫瘤細胞對結構、細胞靶點和作用機理迥然不同的抗癌藥物同時產生耐藥的現(xiàn)象稱為腫瘤多藥耐藥 (multidrugresistanee，MDR)，是腫瘤化療失敗的主要原因。MDR可分為天然性耐藥和獲得性耐藥。前者指細胞在未接觸到上述MDR相關藥物情況下即具有的多藥耐藥性，獲得性耐藥是指接觸后才產生的耐藥性。腫瘤多藥耐藥性是當前基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學研究的熱門領域之一，也是腫瘤治療中魚待解決的難題。MDR產生的機制非常復雜，目前己提出多種可能的途徑。其中，由人類多藥耐藥基因mdr一1所編碼的P一糖蛋白 (Permeabilityglyeoprotein，P一gp)是主要耐藥型之一。P一gp作為能量依賴的藥物泵，將化療藥物主動泵出細胞外，降低腫瘤細胞內的藥物濃度，從而導致腫瘤細胞的耐藥性zl。而要對產生MDR的腫瘤細胞化療成功，需要破壞P一gp介導的藥物抵抗，從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。預防和逆轉多藥耐藥的研究早在10余年前即己經開展，其方法策略主要集中于發(fā)展P一gp的競爭性抑制劑及轉錄調節(jié)因子。如鈣離子通道阻滯劑維拉帕米(Verapamil)和環(huán)抱霉素A(cyelosporinA)等及其衍生物可逆轉多藥耐藥性，但毒性過大和療效不佳限制了這些藥物的臨床應用。近年來發(fā)展的轉錄后基因沉默 (Posttranseriptionalgenesileneing，PTGs)技術提示要阻止腫瘤細胞內P一gp介導的MDR，就要選擇性地阻斷P一gp特異性mdr一lmRNA的表達，從而抑制P一gp的合成，這種方法的目的是在提高耐藥腫瘤細胞藥物敏感性的效率和特異性的同時減少藥物毒性和副作用，研究發(fā)現(xiàn)，應用反義寡核昔酸鏈和核酸酶可以成功地抑制mdr一1mRNA的過度表達Iv。然而在實際應用中，由于抑制效率低，專一性較差和較大的毒性成為目前這一方法所面臨的現(xiàn)實問題，另一方面，用藥量較大、成本過高也影響其臨床應用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，我國的名貴中藥人參具有抗癌活性，其主要活性成分人參皂試(ginsenoside)能誘導細胞分化和凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。其中 Rh:是從紅參中提取的天然活性成分，屬二醇組皂貳，分子式為C36H62OsHZO，分子量622，化學名為20(S)一人參二醇一3一氧一p一D-毗喃葡萄糖營(圖l)，簡稱RhZ，屬于小分子物質且為脂溶性3”。國內外一些學者先后報道Rh:對多種腫瘤細胞如小鼠黑色素瘤B16細胞、C6膠質瘤細胞、人肝癌細胞SK一HEP一1等具有增殖抑制和誘導凋亡作用，并證明對正常細胞的毒性作用甚低【”一，3。而充分利用中醫(yī)扶正培本的理論，發(fā)揮中藥在抗腫瘤研究中的作用，克服腫瘤細胞的耐藥，提高化療的療效，是進一步提高腫瘤治愈率的努力方向和優(yōu)勢所在。本實驗以人乳腺癌細胞系MCF一7為受試對象，研究Rh:對腫瘤細胞生長的抑制作用，并研究Rh:在逆轉MDR方面的作用及其機理，旨在進一步闡述Rh2在抗腫瘤方面的機制。第一部分乳腺癌耐藥細胞株體外模型的建立及其耐藥機理研究對象和方法一、試劑與儀器(一)細胞系與試劑1.人乳腺癌細胞系MCF一7(天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院免疫室提供)2.細胞培養(yǎng)液 RPMI1640(美國 Invitrogenlireteehnologies公司，含loou/ml青霉素和100只g/ml鏈霉素)3.胎牛血清(美國Gibco公司)4.Tris飽和酚、氯仿、異丙醇、無水乙醇、葡萄糖、NaCI(國產分析純)5.核酸提取試劑Trizol(美國 Invitrogenlifeteehnologies公司)6.凝膠電泳試劑Agarose(美國sigma公司)7.Superseript11逆轉錄試劑盒(美國Clonteeh公司)8.AdvantagePolymerasemix(美國 Invitrogenlifeteehnologies公司)9.EXTaq酶(日本TaKaRa公司)10.dNTP(美國Promega公司)11.ADM(美國Sigma公司)12.MTT(美國Sigma公司)13.羅丹明123(美國sigma公司)14.0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)15.EDTA(美國Sigma公司)16.DMSO(美國Sigma公司)17.PE標記P一170鼠單克隆抗體(UICZ)(美國CHEMICON公司)(二)儀器1.常溫離心機(德國Heraeus)2.低溫高速離心機(德國Heraeus)3.水平及垂直電泳設備(BioRAD公司)4.照相設備(BioRAD和Polaroid公司)5.核酸定量分析儀 (BeckmanDU640)6.pCR儀(Eppendorf公司)7.熒光定量pCR儀GeneAmp5700(美國ABI公司)8.倒置顯微鏡(olympus)9.流式細胞儀 (Beckmaneoulter.EPICS.XL)10.酶標儀 (BioTek.SynergyHT)11.CO:培養(yǎng)箱(德國Heraeus)12.制冰機(日本Sanyo公司)13.GMP層流室(天津腫瘤醫(yī)院免疫室提供，衛(wèi)生部驗收合格)二、方法(一)MCF一7細胞的培養(yǎng)1.MCF一7細胞的復蘇和培養(yǎng)(1)取15ml離心管一支，加入10ml含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液。(2)從液氮罐中取出凍存MCF一7細胞一支，將其放入37水浴，輕柔振蕩lmin，使其解凍。待細胞完全溶化后，將凍存管放入70%乙醇中以清除表面污染。(3)打開瓶口，用吸管將解凍的細胞吸入(1)步驟中準備好的15ml離心管中。(4)將離心管在室溫下離心，1000rmpxsmin，棄上清。再加入10ml含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液，重復離心一次，棄上清。(5)在離心管中加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液以重懸細胞。(6)將上步制備的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶中。置37oC、5%COZ孵箱中孵育。(7)每日觀察細胞密度，2一3天換一次培養(yǎng)液。2.MCF一7細胞傳代(1)當細胞長至培養(yǎng)瓶的80%時，進行細胞傳代。首先吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌細胞兩次。(2)加入0.25%胰酶o.sml(加入胰酶量根據(jù)培養(yǎng)瓶大小有不同)，置于37“C、5%COZ孵箱中孵育l一3min。(3)鏡下觀察細胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液使胰酶失活。(4)吹打細胞后，將細胞懸液吸出分裝入新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的培養(yǎng)液。置37oC、5%COZ孵箱中孵育。3.MCF一7細胞凍存(1)觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長旺盛，進入對數(shù)生長期時，用上法胰酶消化細胞(2)用含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細胞一次，然后加入含10%DMSO的FBS，將沉淀細胞團吹打，分裝入凍存管中，每管約lml。(3)將凍存管放入一80過夜，然后放入液氮罐中保存，以備后用。(二)MCF一7/ADM細胞的誘導、篩選和培養(yǎng)1.將MCF一7細胞的培養(yǎng)液中加入o.lmg幾阿霉素，篩選出存活細胞，用含0.lmg/L阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞一個月。2.逐漸增加阿霉素濃度，不斷篩選出存活細胞繼續(xù)培養(yǎng)。每次改變阿霉素濃度后均維持培養(yǎng)一月后再增加濃度。3.選用在含有o.smg/L阿霉素的培養(yǎng)液中生長良好的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，即為MCF一7/ADM細胞。4.MCF一7/ADM細胞的培養(yǎng)、傳代、凍存及復蘇同MCF一7細胞。培養(yǎng)液為含0.smg/L阿霉素和10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液。(三)阿霉素(ADM)對MCF一7和MCF一7/ADM細胞增殖的抑制實驗1.MCF一7和MCF一7/ADM細胞的準備(1)取對數(shù)生長期細胞，當細胞長至培養(yǎng)皿的80%時，吸去培養(yǎng)液。使用sml無菌PBS洗兩次。(2)加入0.25%胰酶0.sml，置于37oC、5%COZ孵箱中孵育l3min。(3)鏡下觀察細胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液使胰酶失活。(4)吹打細胞后，將細胞懸液吸出轉入15ml離心管中。(5)將離心管在室溫下離心， 800rmpxsmin，吸去上清。(6)在離心管中加入含5%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液 1ml以重懸細胞，并計數(shù)。(7)于離心管中繼續(xù)加入含5%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液，將細胞濃度調整為2又loszml。2.種板和加藥(1)將ADM溶于無菌PBS中(2)選擇擬設ADM濃度梯度制成 6580pmol/L(4mg/ml)母液備用。共11個。(3)取%孔板，依ADM濃度梯度計算擬種孔數(shù)(每個濃度設3個復孔)，將細胞懸液吹勻后，用移液槍將MCF一7和MCF一7/ADM細胞分別種于孔中，每孔 50pl，細胞數(shù)為l只104。(4)用含5%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液將ADM母液稀釋為 172pmol/L(稀釋40倍)，注入無菌Eppendorf管中，再依次倍比稀釋，制成86pmol/L，43林mol/L， 21.5協(xié)mol/L， 10.75協(xié)mol/L， 5.33pmol/L， 2.67pmol/L，l.33pmol/L，0.67pmol/L和0.33pmol/L的ADM溶液。(5)將各濃度ADM溶液按序加入各孔，每孔 50ul，使各孔終濃度依次為 86pmol/L， 43pmol/L，21.5林mol/L，10.75pmol/L，5.33pmol/L， 2.67pmol/L， 1.33pmol/L， 0.67pmol/L， 0.33mg/L，0.17mg/L以及opmol/L。Opmol/L為對照組，并設試劑對照孔。最終每孔液量為100pl。3。MTT實驗(l)將96孔板置于37oC、5%COZ孵箱中，分別孵育20h，44h，68h。(2)取出96孔板，室溫下每孔加入MTT液 (smg/L)10pl。(3)再次置于37oC、5%COZ孵箱中，孵育4h(4)將96孔板在室溫下離心，1000rmpxsmin，棄上清。(5)每孔加入DMSO100pl，置室溫中避光放置30min。(6)上酶標儀震蕩305，在波長57Onm段測定各孔吸光度值(A值)。進而計算出細胞生長抑制率，并估算出ADM對MCF一7和MCF一 7/ADM細胞的半數(shù)抑制率 (ADMIC50)。細胞生長抑制率二【1一(實驗組A值一試劑對照組A值)/(對照組A值一試劑對照組A值)IX100%4.實驗重復3次。(四)細胞內羅丹明123留滯實驗1.MCF一7和MCF一7/ADM細胞的準備(1)取對數(shù)生長期細胞，當細胞長至75cm2培養(yǎng)皿的80%時，吸去培養(yǎng)液。使用10ml無菌PBS洗兩次。(2)加入0.25%胰酶l.oml，置于37oC、5%C02孵箱中孵育l一3min。(3)鏡下觀察細胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液 1oml使胰酶失活。(4)吹打細胞后，將細胞懸液吸出轉入15ml離心管中。(5)將離心管在室溫下離心， 800rmpXsmin，吸去上清。(6)在離心管中加入新鮮 RPMI1640培養(yǎng)液 1ml以重暴細胞，并計數(shù)。(7)于離心管中繼續(xù)加入 RPMI1640培養(yǎng)液，將細胞濃度調整為ZXlo6zml待用。2.將MCF一7和MCF一 7/ADM細胞吹勻后分別注入無菌Eppendorf管中，每管lml。3.每管加入羅丹明123(l.omg/ml)spl(終濃度為5“g/ml)，37OC、5%tCO:孵箱中孵育60min。4.室溫下離心，1500rmpxZmin，棄上清。5.PBS液洗2遍后，用 lmlPBS重新懸浮細胞并移入流式管中。6.流式細胞儀用488nm激發(fā)光測定各組細胞熒光強度。7.實驗重復3次。(五)人參皂貳R婉影響MCF一7lADM細胞mdrl基因表達的實驗1.MCF一7和MCF一 7/ADM細胞的準備(l)取對數(shù)生長期細胞，當細胞長至培養(yǎng)皿的80%時，吸去培養(yǎng)液。使用15ml無菌PBS洗兩次。(2)加入0.25%胰酶 1.sml，置于37OC、5%C02孵箱中孵育l一3min。(3)鏡下觀察細胞變圓時，加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液 1oml使胰酶失活。(4)吹打細胞后，將細胞懸液吸出轉入15ml離心管中，并計數(shù)。2.將McF一7和McF一7/ADM細胞吹勻后分別種入25。mZ培養(yǎng)瓶中，每瓶細胞數(shù)應)lxl護細胞。3.每瓶再加入含10FBSRPMI1640培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液量為10ml,375%COZ孵箱中孵育24h。4.用Trizol提取細胞總RNA(l)將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去，加入適量的Trizol，吹打后移入Eppendorf管中。確保細胞完全裂解，液體基本澄清。(2)將上述Eppendor增室溫靜置 1smin，加入氯仿(200林 l/lmlTrizol)，振蕩，室溫靜置一omin，4， 12oooXg，離心lomin。(3)小心吸取上層水相置于另一個新的無菌EpPendor增中，加入異丙醇(500林l八 mlTrizol)，上下顛倒混勻，室溫靜置10min，4，C， 12000Xg，離心lomin。棄上清。(4)用80%乙醇(lml八mlTrizol)洗沉淀，4oC， 750oXg，離心smin，棄上清。重復此操作一次，吸凈乙醇，將Eppendor增口朝下傾斜放在無菌吸水紙上，室溫靜置15一ZOmin，使沉淀自然干燥。5.RNA定量(1)將RNA沉淀溶于DEPC處理的DDW中，取適量稀釋50倍后于分光光度計260nm處讀數(shù)。(2)按下式計算RNA濃度:RNA(林 g/ml)=40X0D26。 X50(稀釋倍數(shù))(3)計算取2林gRNA所需各標本體積。其余RNA標本80保存?zhèn)溆谩?.以RNA為模板，RT.PCR擴增目的基因mdri和內對照p一actin(l)盯實驗(總體系20卜l)配制如下反應體系，置于PE一9600型PCR儀中，“，smin，然后立即置于冰上。在反應體系中加入以下試劑，置于PE一9600型PCR儀中10mill。-，.二，妞.孟、以林林林、將以上體系置于PE一9600型PCR儀中，42oC，3min;加入 SuperseriPt111卜1(20ou)。42oC，60min;然后75oC， 1smin。加入 RnaseHI林l(Zu)，37，20min。反應所得eDN加入DEPe處理的DDwso林l，使之成為 100林l，一20oC保存?zhèn)溆谩?2) 引物設計（表1）(3) 熒光定量PCR反應(六)MCF一7和MCF一7lADM細胞P一gp蛋白表達的實驗1.將MCF一7和MCF一7/ADM細胞消化、吹勻后分別種入6孔板中，每孔1Xlo6細胞。2.每孔再加入含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液lml，37OC、5%C02孵箱中孵育24h。3.吸去培養(yǎng)液，每孔使用2ml無菌PBS洗兩次。4.每孔加入0.25%胰酶0.sml，置于37oC、5%COZ孵箱中孵育l一3min。5.鏡下觀察細胞變圓時，每孔加入含10%FBS的RPMll“0培養(yǎng)液Zm使胰酶失活。6.吹打細胞后，將細胞懸液吸出轉入流式管中，并計數(shù)，每組細胞數(shù)應妻IXlo6。7.4oC離心，800xg，smin，棄上清。8.PBS洗細胞兩次，800xg，smin，棄上清。9.每管加入用pE(Rphyeoe仔thrin)標記的鼠xgo，或同型對照20協(xié)l。10.經室溫避光孵育30min后上流式細胞儀檢測。11.實驗重復3次。(七)統(tǒng)計學分析實驗結果以x士s表示，兩組之間比較采用t檢驗，P0.05為具有顯著性差異。結果一、MCF一7和MCF一7/ADM的 ADMICS。的差別。結果顯示，MCF一7/ADM的ADMIC，。明顯高于MCF一7，兩者相差約58倍(表2，圖2)。二.MCF一7和MCF一7/ADM細胞內羅丹明123熒光表達的差別。培養(yǎng)體系加入等量羅丹明1