K-ras野生型大腸癌發(fā)生與MAPK.doc

二、立論依據(jù) （包括項(xiàng)目的研究意義、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處） 對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國(guó)際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，論述項(xiàng)目的科學(xué)意義；對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科技問(wèn)題，論述其應(yīng)用前景。關(guān)于大腸癌的發(fā)生，長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為有兩種學(xué)說(shuō)，即：adenoma-carcinoma-sequence學(xué)說(shuō)(先有良性腺瘤，之后一部發(fā)生癌變)和de novo學(xué)說(shuō)(直接從正常粘膜發(fā)生癌變)。Vogelstein于1988年對(duì)正常組織腺瘤癌組織進(jìn)行了詳細(xì)解析，完成了adenoma-carcinoma-sequence(polyp-carcinoma sequence)的多階段發(fā)癌模型，即：在小的腺瘤階段C-myc發(fā)生異常，隨著腺瘤增大K-ras基因出現(xiàn)點(diǎn)突變及P53，DCC等基因異常使腫瘤的一部分發(fā)生癌變。這一機(jī)制基本清楚。而de novo型發(fā)癌機(jī)制還不清楚。日本學(xué)者藤盛孝博教授(申請(qǐng)者的指導(dǎo)教授)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，在de novo型發(fā)癌過(guò)程中，K-ras基因基本不參與，此型癌的發(fā)生可能是由K-ras以外的其他未知的癌基因參與所致。Ras基因作為人類(lèi)大腸癌發(fā)癌的重要基因被廣泛研究?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，K-ras基因的突變(K-ras活性型)在人大腸癌的檢出率為40-50%4，5，而其余50-60%的不伴有K-ras基因點(diǎn)突變(K-ras野生型)大腸癌(其中一部為de novo型發(fā)癌者)的發(fā)生被認(rèn)為是由K-ras基因以外的未知癌基因所致。研究證明，Ras基因作為細(xì)胞增殖與分化的信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)子起重要作用。它的靶蛋白有Raf、MEKK及P2-3激酶等。其中，古典的MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號(hào)傳導(dǎo)系(RasRaf-1MEKMAPK)在細(xì)胞增殖，分化及發(fā)癌過(guò)程中起重要作用。它們具有傳導(dǎo)上位特異的激酶依次磷酸化和激活下位特異激酶的特性。即：Ras活性型激活Raf(MAPKKK),Raf激活MEK(MAPKK)，MEK激活MAPK。然后，由小分子的MAPK將信息轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，引起細(xì)胞核內(nèi)染色體改變。因此，MAPK的活性可能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的信號(hào)傳遞中起到一個(gè)連接作用。新近的研究提示“MAPK的活性異常可能與發(fā)癌有關(guān)6，7。一些纖維母細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，作為MAPK的新家族成員的JNK(c-JunN-terminal Kinase)信號(hào)傳導(dǎo)系也受Ras活化的影響，可能參與Ras活性型細(xì)胞癌變8。9。近年的研究雖然提示MAPK，JNK參與了細(xì)胞癌變，但人大腸癌與K-rasRaf-1MEKMAPK以及與JNK傳導(dǎo)系間關(guān)系尚不清楚10。11。12，13，14。尤其是K-ras野生型及K-ras活性型大腸癌與MAPK及JNK信號(hào)傳導(dǎo)系間關(guān)系方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。倘若在大腸癌中(尤其在K-ras野生型)發(fā)現(xiàn)有MAPK或JNK等蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)異常(蛋白過(guò)表達(dá)，磷酸化或發(fā)現(xiàn)其點(diǎn)突變)，將會(huì)對(duì)闡明大腸癌的發(fā)生機(jī)制，特別是為探討K-ras野生型大腸癌、de novo型癌發(fā)生機(jī)制提供有力依據(jù)。此乃本項(xiàng)目的主要意義所在。近來(lái)研究還表明大腸癌的K-ras codon13點(diǎn)突變與大腸癌預(yù)后有關(guān)5。就是說(shuō)K-ras基因變異可能是判定大腸癌預(yù)后一個(gè)重要指標(biāo)。在我們最近的實(shí)驗(yàn)中，不論在大腸癌細(xì)胞株，還是在大腸癌組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了MAPK的活性。有趣的是，K-ras Codon13有突變的大腸癌組織及細(xì)胞株內(nèi)MAPK活性均低于正常組織。這些都提示此類(lèi)型大腸癌的癌變可能是通過(guò)不同于Ras/MAPK途徑的其它方式(JNK?)發(fā)生的；與K-ras有關(guān)的MAPK及JNK信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶可能參與了大腸癌的發(fā)生，可能會(huì)對(duì)大腸癌的分期、病理類(lèi)型、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判定提供分子生物學(xué)依據(jù)，對(duì)這些問(wèn)題的探討也是本研究的目的和意義之一。3-1對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國(guó)際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，論述項(xiàng)目的科學(xué)意義；對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科技問(wèn)題，論述其應(yīng)用情景。1. Vogelstein.B.,Fearon,E.R,.Bos,J.L. Genetic alteration during colorectal-tumor development. New Engl.J.Med,1988,319:525-523.2. Fearon ER,Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell,1990,61:759- 767.3. Bedenne.L.Faivre,J.Hillon,P. Adenoma-carcinoma sequence or “de novo” carcinogenesis? Cancer,1992,69:883-888. 4. Takahiro Fujimori,Kazuhiro satonaka,Sakan Maeda. Non-involvement of ras mutations in flat colorectal adenomas and carcinomas . Int. J. Caner ,1994,57:51-55. Bo,J.L.,Fearon,E.R.,Hamiton,S.R. Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancers. Nature,1987,327:293-297.6. Forrester,K.,Almoguera,C.,Han,K. Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis. Nature,1987,327:298-303. 7. Sally C.,Hugh,P.,Christopher J.M. Activation of MAP Kinase Kinase is necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell, 1994,77:841- 852.8. 胡長(zhǎng)燈 戚曉東 片岡澈. Effect of phosphorylation on activities of RaplA to interact with Raf-1 and to suppress Ras-dependent Raf-1 activation. J. BioChem. 1999，274(1)：48-51. 9. Heiner.S.,Jie ZH.,Friedeirke G. Pituitary adenylate-cyclase-activating Polypeptide stimulates proto-oncogene expression and activates the AP-1 (c-Fos/c-Jun) transcription factor in AR4-2J pancreatic carcinoma cells. Eur.J.Biochem,1996,242:467-476. 10. Randall,S.F.,Kathleen,M.M. Involvement of Extracellular signal-regulated Kinase2 and stress-activated protein Kinase / Jun N-terminal Kinase Activation by Transforming Growth Factor in the Negative Growth control of Breast cancer cells. Cancer Research, 1997,57:628- 633.11. Hiroya Oka,Yuji. Chatani,Osamu Yoshida, Constitutive Activation of Mitogen-activated- Protein (MAP) Kinases in Human Renal cell carcinoma. Cancer Research, 1995,55:4182-41812. Mariko Ohmori, Senji Shirasawa. Activated Ki-ras/stress-activated protein Kinase or Extracellular signal-regulated Kinase Activation in Human Colon Cancer cells. Cancer Research. 1997,57:4714-4717.13. Yasushi Kuno,Ken Konso .Tumor-specific activation of mitogen-activated protein kinase in human colorectal and gastric carcinoma tissues. Jpn. J. Cancer Res,1998,89:903-909.14. MiKi H.Yamada H.Mitamura,K. Involvement of P38 MAP Kinase in apoptotic and proliferative alteration in human colorectal cancers. Anticancer Research 19(6B):5283-91,1999 Nov-Dec.15. Anthony J.Senagore,Jennifer Thebo Biener. A newly identified pattern of K-ras mutations at codons 12 and 13 is associated with long-term survival in colorectal cancer. Surgery 1997,122:765-770. 三、研究方案1.研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題研究目標(biāo)：1)研究MAPK、JNK等信號(hào)傳導(dǎo)系蛋白激酶的活性與K-ras野生型(K-rasWT)及K-ras活性型人類(lèi)大腸癌發(fā)生的關(guān)系，探討人大腸癌發(fā)生機(jī)制；尤其要闡明K-ras野生型大腸癌的發(fā)生機(jī)制，為研討de novo型大腸癌發(fā)生機(jī)制提供分子生物學(xué)依據(jù)。2)比較和探討MAPK、JNK等信號(hào)傳導(dǎo)系蛋白激酶的活性及K-ras的變異與大腸癌的臨床病理特征(病期、類(lèi)型、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后)的相關(guān)關(guān)系，為臨床診療及預(yù)后判定提供分子生物學(xué)依據(jù)。研究?jī)?nèi)容：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)手段將人大腸癌(組織及細(xì)胞株)分為K-ras野生型和K-ras活性型；用特異抗體(western blot法)測(cè)定和比較兩型大腸癌的MAPK及JNK信號(hào)傳導(dǎo)系各蛋白激酶的活性，從而探討K-ras及MAPKJNK信號(hào)傳導(dǎo)系與大腸癌發(fā)生及臨床病理特征的關(guān)系。一、 人大腸癌的K-ras基因的分類(lèi)(野生型和活性型)及分布的研究。二、 測(cè)定K-ras野生型及K-ras活性型大腸癌的各自下位信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶Raf-1,MEK,MAPK等的活性水平。并比較這些蛋白激酶與此兩型(尤其是K-ras野生型)大腸癌發(fā)生的相互關(guān)系。三、 人大腸癌的K-ras Codon12、13、61出現(xiàn)的點(diǎn)突變與MAPK等蛋白激酶活性間的關(guān)系。四、 K-ras Codon13有點(diǎn)突變的大腸癌與JNK信號(hào)傳導(dǎo)系蛋白激酶活性間的關(guān)系。五、 比較上述諸蛋白激酶的活性、突變與人大腸癌不同臨床病理特征(病期、類(lèi)型、轉(zhuǎn)移及預(yù)后)的相關(guān)關(guān)系。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題： 1. 測(cè)定K-ras野生型大腸癌的MAPK及JNK等信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶的活性方法。2. 評(píng)價(jià)伴有K-ras Codon13突變的大腸癌的發(fā)生與JNK傳導(dǎo)路徑相關(guān)性及檢測(cè)手段。3. 大腸癌不同臨床病理特征所表現(xiàn)在K-ras點(diǎn)突變及MAPK，JNK信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶活性上的分子生物學(xué)特點(diǎn)。42.擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析(之一) 技術(shù)路線及實(shí)驗(yàn)方案：將手術(shù)中獲得的大腸癌組織及癌周正常粘膜迅速冷凍保存在-80。從癌組織及其周?chē)Ｕ衬ぶ刑崛NA，通過(guò)PCR-直接序列法測(cè)定K-ras Codon12、13、61的點(diǎn)突變，將其分為K-ras活性型(有K-ras基因突變者)與K-ras野生型(無(wú)K-ras基因突變者)。稱等量癌及其周?chē)＝M織行蛋白提取。使用特異抗體通過(guò)Western blot法測(cè)定蛋白提取液中的MAPK及JNK的表達(dá)及磷酸化水平。如果，在K-ras野生型大腸癌(K-rasWT)中發(fā)現(xiàn)MAPK蛋白激酶活性，要用各自特異抗體追加檢測(cè)其上位蛋白激酶(MEK、Raf)的活性是否存在，如有異常，還將檢測(cè)各蛋白激酶的基因有否點(diǎn)突變。同時(shí)，還要進(jìn)行JNK蛋白激酶活性測(cè)定，如發(fā)現(xiàn)異常，用上述方法分別檢測(cè)及分析JNK的上位蛋白激酶(Rac、Cdc42、PAK、MEKK、SEK1)的活性，如有異常再根據(jù)PCR-直接序列法檢測(cè)其基因有否點(diǎn)突變。通過(guò)此方法找出信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶的活性異常或基因突變與大腸癌發(fā)生的關(guān)系。同時(shí)，還將比較信號(hào)傳導(dǎo)蛋白異常與大腸癌的臨床病理特征間的關(guān)系。研究方法：1)組織標(biāo)本：共50例分別來(lái)自日本神戶大學(xué)第一外科和北京首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院外科于1997-2000年手術(shù)切除的大腸癌組織及其鄰近的正常粘膜組織。這些標(biāo)本用冰生理鹽水沖洗后急速冷凍在液氮或-80冰箱中直到實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。2)細(xì)胞株三種人大腸癌細(xì)胞株HT29，SW480和DLD-1均來(lái)自日本癌研究材料庫(kù)。HT29細(xì)胞為K-ras野生型大腸癌細(xì)胞。SW480細(xì)胞，DLD-1細(xì)胞為K-ras活性型。3)細(xì)胞及組織內(nèi)蛋白提取取等數(shù)量的細(xì)胞(株)和稱取等量癌組織及其周?chē)＝M織，各自經(jīng)過(guò)前處理成為勻漿后，用SDS標(biāo)本緩沖液制成懸液。高速離心，收集上清(蛋白)，貯存在-20，待蛋白測(cè)定。4)DNA提純和PCR擴(kuò)增用DNA Kit從大腸癌細(xì)胞及癌標(biāo)本組織中提取DNA，對(duì)其定量。然后將此DNA作為模板在Codon12，Codon13及Codon61處進(jìn)行擴(kuò)增。產(chǎn)生約100bp PCR產(chǎn)物。5)測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物用DEAE紙從瓊脂膠上提純并用測(cè)序PCR進(jìn)行定量。用20-50g純化的PCR產(chǎn)物作為模板，在加有dRhodamine Terminator Cycae測(cè)序藥盒內(nèi)容的儀器上用3引物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，用ABI PRISMTM310基因分析儀對(duì)測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。并對(duì)變異點(diǎn)上的弱信號(hào)，通過(guò)亞克隆PCR產(chǎn)物到一個(gè)質(zhì)粒載體上，然后再選出單克隆進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)突變點(diǎn)上的弱信號(hào)是否真正存在變異，以除外假陽(yáng)性。5-12.擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析(之二)6)MAPK及c-Jun(是JNK的靶蛋白，它可反映JNK的活性)等蛋白激酶活性測(cè)定使用測(cè)定MAPK、MEK、Raf-1及c-Jun等蛋白激酶的表達(dá)(免疫活性)及磷酸化(生物活性)的特異抗體藥盒，對(duì)從細(xì)胞株、癌組織、正常粘膜中提取的蛋白提取液進(jìn)行Western blot法測(cè)定。先加入蛋白表達(dá)抗體測(cè)蛋白表達(dá)量，再將該抗體從膜上洗脫下后加入蛋白磷酸化抗體測(cè)其活性，蛋白活性的測(cè)定要求每例癌組織要與相應(yīng)病例的癌周?chē)Ｕ衬ぴ谕粡埬ど贤瑫r(shí)成對(duì)等量對(duì)照測(cè)定。比較K-ras野生型與活性型大腸癌的MAPK、MEK、Raf-1及c-Jun等蛋白表達(dá)及磷酸化情況，找出MAPK、JNK等蛋白激酶與大腸癌發(fā)生的關(guān)系。7)比較K-ras活性型及K-ras野生型大腸癌的病期、類(lèi)型、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后(生存率)等臨床病理特征與各信號(hào)傳導(dǎo)蛋白活性異常的相關(guān)關(guān)系。8)在信號(hào)傳導(dǎo)蛋白水平上比較中國(guó)人與日本人大腸癌發(fā)生的異同?？尚行苑治觯赫n題組的主要成員多為博士(2人)和碩士(1人)。其中2人已在國(guó)外實(shí)驗(yàn)室工作和學(xué)習(xí)6年以上，已熟練地掌握實(shí)驗(yàn)所需的分子生物學(xué)技術(shù)；碩士及技術(shù)員也掌握了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。如：細(xì)胞培養(yǎng)、DNA提取、PCR擴(kuò)增、點(diǎn)突變的測(cè)序分析及用特異抗體(Western blot法)測(cè)定各蛋白的表達(dá)及磷酸化等技術(shù)。故本課題組完全有能力完成本課題。本校和本院實(shí)驗(yàn)室具備與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的儀器及設(shè)備。實(shí)驗(yàn)所需材料、試劑的大部分可由日方贈(zèng)送。課題負(fù)責(zé)人已完成前期實(shí)驗(yàn)，并取得了一些很有趣和有指導(dǎo)意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)有成功的把握。3.本項(xiàng)目的創(chuàng)新之處 研究是否MAPK及JNK信號(hào)傳導(dǎo)系參與大腸癌發(fā)生。探討K-ras野生型大腸癌的發(fā)生機(jī)制，將會(huì)為完善大腸癌的發(fā)生學(xué)說(shuō)提供依據(jù)。在前期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了在K-ras Codon13有突變的大腸癌組織及大腸癌細(xì)胞株的MAPK活性低于正常組織這一有趣的現(xiàn)象。它提示此類(lèi)型大腸癌的癌變可能是通過(guò)不同于Ras/MAPK途徑的其他(JNK等信號(hào)傳導(dǎo)路)方式發(fā)生的。它可能對(duì)大腸癌的發(fā)生機(jī)制有重要意義。將K-ras點(diǎn)變異及MAPKJNK活性化與大腸癌的臨床病理特征進(jìn)行比較，討論大腸癌的不同臨床病理特征與信號(hào)傳導(dǎo)蛋白間的關(guān)系，為臨床診療及判斷預(yù)后提供依據(jù)。5-24. 年度研究計(jì)劃及預(yù)測(cè)進(jìn)展第一年度：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(三種人大腸癌細(xì)胞株即：SW480，DLD-1及HT29)1.DNA和蛋白的提取2.K-ras點(diǎn)突變測(cè)定3.MAPK,MEK,Raf-1,c-Jun等蛋白表達(dá)及磷酸化的測(cè)定(必要時(shí)做點(diǎn)突變測(cè)定) 第二年度：組織實(shí)驗(yàn)(50例人大腸癌的發(fā)生及組織及正常粘膜)1.DNA和蛋白的提取2.K-ras點(diǎn)突變測(cè)定3. MAPK，MEK，Raf-1及c-Jun等蛋白表達(dá)及磷酸化的測(cè)定(必要時(shí)做點(diǎn)突變測(cè)定)第三年度：1.比較和探討K-ras點(diǎn)變異、MAPK及JNK等蛋白的活性化與大腸癌的發(fā)生及其臨床病理特征的關(guān)系。2.比較和探討中國(guó)和日本不同地域間大腸癌的發(fā)生和預(yù)后與K-ras點(diǎn)變異、MAPK及JNK等蛋白活性化的關(guān)系。3.數(shù)據(jù)處理、分析，工作總結(jié)，撰寫(xiě)論文5.預(yù)期研究成果1.證明大腸癌的K-ras分子生物學(xué)分型(野生型及活性型)對(duì)大腸癌發(fā)生學(xué)等方面的研究有重要意義。2.證明人大腸癌組織及細(xì)胞株內(nèi)存在MAPK或JNK等信號(hào)傳導(dǎo)系蛋白的表達(dá)及磷酸化的異常和點(diǎn)突變，揭示它們參與人大腸癌的發(fā)生。3.發(fā)現(xiàn)K-ras野生型大腸癌的發(fā)生與MAPK或JNK信號(hào)傳導(dǎo)系蛋白的異常有關(guān)，為半數(shù)以上的大腸癌的發(fā)生找到分子生物學(xué)依據(jù)。4.發(fā)現(xiàn)K-ras Codon13有點(diǎn)突變的大腸癌組織及細(xì)胞株內(nèi)MAPK活性低于正常組織，提示此類(lèi)型大腸癌的發(fā)生可能是通過(guò)不同于Ras/MAPK途徑的其他方式發(fā)生的；即：可能與JNK等蛋白激酶異常有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)將證明這一點(diǎn)；它將為下一步實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。5. K-ras點(diǎn)變異及MAPKJNK等信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶異?？赡芘c大腸癌的不同臨床病理特征有關(guān)。即，與大腸癌病期、類(lèi)型、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等有關(guān)。這可能成為判定大腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)臨床診療有指導(dǎo)意義。6.爭(zhēng)取為de novo型大腸癌的發(fā)病機(jī)制闡明方面提供分子生物學(xué)依據(jù)。7.研究成果以論著發(fā)表形式(國(guó)際級(jí)及國(guó)家級(jí)論文3-5篇)及科研成果鑒定。6 四、研究基礎(chǔ)1. 與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)本人原來(lái)所屬研究室(中國(guó)醫(yī)大腫瘤研究所)多年來(lái)主要從事胃腸腫瘤的病因、病理診斷及治療學(xué)方面的研究，承擔(dān)過(guò)國(guó)家自然科學(xué)基金兩項(xiàng)、衛(wèi)生部基金四項(xiàng)、遼寧省科委等省級(jí)課題二十余項(xiàng)，獲資助180余萬(wàn)元，獲國(guó)家，部、省、市級(jí)將多項(xiàng)。目前所在醫(yī)院的中心實(shí)驗(yàn)室具備本實(shí)驗(yàn)所需各種條件和設(shè)備。申請(qǐng)者一直從事消化道腫瘤的研究及臨床工作，在國(guó)內(nèi)外雜志上發(fā)表有價(jià)值的論文十余篇。并且三次留學(xué)日本，在著名專家指導(dǎo)下做了大量實(shí)驗(yàn)室研究工作。即：熟練掌握了細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA、同位素測(cè)定蛋白活性、DNA蛋白的提取、PCR-直接序列(Sequence)法測(cè)定、DNA點(diǎn)突變、Western blot法測(cè)定蛋白表達(dá)及磷酸化等實(shí)驗(yàn)方法。前期實(shí)驗(yàn)中在大腸癌細(xì)胞株及大腸癌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了MAPK的活性。還發(fā)現(xiàn)，K-ras codon13有突變的大腸癌組織及大腸癌細(xì)胞內(nèi)的MAPK活性低于正常組織。它提示此類(lèi)型大腸癌的癌變可能是通過(guò)不同于Ras