與PCR相關(guān)的計(jì)算機(jī)知識(shí)的應(yīng)用課件.doc

第一章 引物設(shè)計(jì)的原則首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，再次引物不能在別的非目的位點(diǎn)引起DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。圍繞這幾條基本原則，設(shè)計(jì)引物需要考慮諸多因素，如引物長(zhǎng)度（primer length）、產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、G值(internal stability)、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）、錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)（false priming site）、引物及產(chǎn)物GC 含量（composition），有時(shí)還要對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制酶切點(diǎn)，引進(jìn)突變等?？偨Y(jié)出以下的要點(diǎn)：1.引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，即Taq 酶的最適溫度。2.引物3端的序列要比5端重要。引物3端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR 影響不大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。3.引物的GC含量一般為40-60%，以45-55為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5端增加As或Ts；而如果A-T比例過(guò)高，則同樣在5端增加Gs或Cs。但也有認(rèn)為：原來(lái)普遍認(rèn)為PCR引物應(yīng)當(dāng)有50%的GC/AT比率的觀點(diǎn)其實(shí)是不對(duì)的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產(chǎn)生單一的、專一的、長(zhǎng)250 bp，含有70% AT的產(chǎn)物。完全沒(méi)有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。4. 引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm 值最好在72左右。（Tm 值曲線以選取72 度附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)），至少要在5580之間。5. G值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對(duì)較低，且不要超過(guò)9（G值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3末端雙鏈的G是02 kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6時(shí)只有40%、到8時(shí)少于20%、而10時(shí)接近于0。6. 可能的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯(cuò)誤引發(fā)率高，錯(cuò)誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過(guò)100，如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450 以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對(duì)引物也是可以接受的。7. Frq 曲線為Oligo6新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片斷存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用Frq 值相對(duì)較低的片斷。8. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過(guò)4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3端的連續(xù)GGG 或CCC 會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其G為3 kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果，但是如果它的3末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在5末端對(duì)反應(yīng)就沒(méi)有多大的影響了。9. 以公式(4G/C + 2A/T5)計(jì)算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度。4-6的差別似乎對(duì)PCR產(chǎn)量影響不大。最好，保證每個(gè)引物的Tm值相匹配，且在70-75范圍內(nèi)。10. 要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因?yàn)镈NA的解鏈溫度也取決于它的長(zhǎng)度，所以有的研究者喜歡設(shè)計(jì)很長(zhǎng)，而不求它很穩(wěn)定的引物?？墒牵锾L(zhǎng)就難以避免形成二聚體和自身互補(bǔ)，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500 bp，選用短的(1618 mer)的引物：若產(chǎn)物長(zhǎng)5 kb，則用24 mer的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的產(chǎn)物。11. 在DNA測(cè)序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)之談。其3末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的堿基與非靶位點(diǎn)堿基所形成的配對(duì)的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會(huì)產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對(duì)，只憑借其3末端與靶序列任何位點(diǎn)的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無(wú)論如何，寡核苷酸3末端最后5個(gè)核苷酸的穩(wěn)定性小于9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。12. 如果用3末端低穩(wěn)定性的引物，反應(yīng)的最適退火溫度范圍會(huì)不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過(guò)事先的最佳化實(shí)驗(yàn)就能在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)。13. 引物的唯一性：為了放大單個(gè)的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一的，即在模板中沒(méi)有重復(fù)序列。如果用哺乳動(dòng)物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復(fù)元件來(lái)核對(duì)想用的引物的互補(bǔ)性。由此也可知，應(yīng)當(dāng)避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重復(fù)(如ATATAT)。14. 引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長(zhǎng)度范圍。15. 對(duì)引物的修飾一般是增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)參考載體的限制酶識(shí)別序列確定，常常對(duì)上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識(shí)別序列，以有利于以后的工作。16. 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件較差，比如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；有時(shí)PCR產(chǎn)物要作為克隆對(duì)象插入到載體中表達(dá)，因此PCR引物設(shè)計(jì)的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時(shí)，使用自動(dòng)搜索引物及正確地評(píng)價(jià)引物可使研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)心中有數(shù)。17. 在設(shè)計(jì)克隆PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低，這種PCR需要靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。18. 如擴(kuò)增出多條帶（引發(fā)錯(cuò)配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發(fā)效率低下）。第二章Primer Premier 5.0Primer Premier是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)，評(píng)估的軟件。其主要界面同樣也是分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計(jì)窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（Motif）。這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能，其他功能的介紹請(qǐng)參看Plasmid Premier2.02。打開程序首先進(jìn)入的是序列編輯參看，有一個(gè)語(yǔ)音校正的功能，即在輸入序列的時(shí)候，程序自動(dòng)將堿基讀出，以便用戶進(jìn)行校正，保證輸入的正確和快速。點(diǎn)擊該界面的按鈕即可進(jìn)入到程序的引物設(shè)計(jì)窗口。該界面共分為四層，最上面一層左面是5個(gè)控制按鈕，用于實(shí)現(xiàn)引物設(shè)計(jì)中的各種功能，包括引物自動(dòng)尋找，尋找結(jié)果查看和引物編輯；右邊是觀察兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖以及對(duì)正鏈還是負(fù)鏈引物進(jìn)行選擇；第二層是顯示模板和引物序列及二者間的配對(duì)情況的顯示；第三層是顯示兩個(gè)引物的各種參數(shù)，包括給引物的打分，引物以及產(chǎn)物的起始位置、長(zhǎng)度、Tm值、GC消光系數(shù)、簡(jiǎn)并性；最后一層是給出的有關(guān)于引物的二聚體結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配情況和引物間二聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，左邊是顯示是否存在以上各種對(duì)PCR擴(kuò)增有影響的結(jié)構(gòu)，右邊顯示的是這些結(jié)構(gòu)的位置，結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和穩(wěn)定能，利用這些參數(shù)可以對(duì)引物作出可靠的評(píng)價(jià)。下面是根據(jù)模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設(shè)定所要搜索的引物的類型，包括PCR引物，測(cè)序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設(shè)定搜索引物的范圍，以及最終PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和引物的長(zhǎng)度等。并通過(guò)來(lái)點(diǎn)擊按鈕來(lái)設(shè)置一些搜尋參數(shù)：這些參數(shù)包括引物的Tm值，GC比，有簡(jiǎn)并性堿基，3端穩(wěn)定性，引物的穩(wěn)定性，重復(fù)序列，二聚體/發(fā)卡結(jié)構(gòu)和與模板及可能的雜質(zhì)DNA（需要從另外的序列文件中讀入）之間的錯(cuò)配情況，這些參數(shù)的設(shè)定可以根據(jù)要求變化，程序本身根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)分成從極高嚴(yán)謹(jǐn)性到極低嚴(yán)謹(jǐn)性5個(gè)檔次。該程序?qū)σ锏淖詣?dòng)搜索過(guò)程是采用的排除法，根據(jù)用戶設(shè)定的引物范圍和產(chǎn)物長(zhǎng)度所規(guī)定區(qū)域內(nèi)，所有的符合設(shè)定的引物長(zhǎng)度的寡核苷酸都被視為可能的引物，然后根據(jù)以上各個(gè)參數(shù)逐步去除不符合條件的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)這種層層剔除的篩選，最終找到符合用戶所設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的引物，如果找不到合適的引物可以逐步降低要求來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步搜尋。搜尋到引物結(jié)果最終顯示在下面的窗口中：在結(jié)果窗口中給出了程序給該對(duì)引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長(zhǎng)度以及產(chǎn)物的長(zhǎng)度。通過(guò)直接點(diǎn)擊各對(duì)引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu)。其中用File菜單中的Parameter命令可以對(duì)系統(tǒng)參數(shù)，PCR反應(yīng)條件和程序打分系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)置，以幫助用戶根據(jù)自己的特殊要求來(lái)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中反應(yīng)條件按照引物濃度，單價(jià)離子濃度，Mg離子濃度，Na鹽濃度等。而打分系統(tǒng)是參照的以下公式：利用該打分系統(tǒng)可以為對(duì)引物進(jìn)行有效評(píng)估和和在引物之間進(jìn)行對(duì)比選擇提供有效的依據(jù)。最后還可以在利用引物編輯窗口對(duì)程序自動(dòng)找到的或手工找到的引物序列進(jìn)行編輯，以便用戶能在引物引入突變及加入特定的酶切位點(diǎn)，并對(duì)修改后的序列的二聚體結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配進(jìn)一步評(píng)估。其中是對(duì)修改后的引物再次搜尋找出其最合適的引發(fā)位置。除了以上的直觀地對(duì)引物進(jìn)行基本的設(shè)計(jì)和評(píng)估功能外，該程序還提供了多種數(shù)據(jù)報(bào)告，主要通過(guò)Report菜單和Graph菜單中命令來(lái)實(shí)現(xiàn)：另外，Primer Premier在引物設(shè)計(jì)上一個(gè)比較獨(dú)到的功能，就是能輔助進(jìn)行巢式PCR引物設(shè)計(jì)，在首先進(jìn)行了引物自動(dòng)搜索后，即可通過(guò)Function菜單中Multiplex/Nested Primer命令進(jìn)入巢式PCR引物設(shè)計(jì)，通過(guò)點(diǎn)中代表各個(gè)引物的三角號(hào)來(lái)選擇引物，然后根據(jù)最下面的窗口中各個(gè)引物之間的二聚體形成情況來(lái)判斷引物是否適合于作為巢式PCR的引物。另外該菜單中的Database命令可以讓用戶建立自己的引物數(shù)據(jù)庫(kù)，方便于查找和對(duì)照。整體而言，Primer Premier這個(gè)軟件在引物設(shè)計(jì)方面還是比較優(yōu)秀的，能夠?qū)θ娴慕o出一個(gè)引物的各種參數(shù)，并在多個(gè)必需的方面對(duì)引物作出有效的評(píng)價(jià)，但是在程序設(shè)計(jì)中還有一些不足，例如在錯(cuò)配情況中，只對(duì)是否存在錯(cuò)配作出了預(yù)測(cè)，也給處理錯(cuò)配的穩(wěn)定性，但是錯(cuò)配對(duì)PCR的影響還需要根據(jù)錯(cuò)配是否發(fā)生在引物的3來(lái)判斷，3發(fā)生的錯(cuò)配要比其他位置的錯(cuò)配對(duì)引物的引發(fā)效率的影響大的多，所以在使用中應(yīng)當(dāng)結(jié)合著錯(cuò)配的具體配對(duì)情況來(lái)綜合分析，這方面程序未能進(jìn)行量化，只有通過(guò)用戶根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷；另外，程序?qū)τ诋a(chǎn)物的Tm值和引物Tm值之間的差異也為能給出評(píng)價(jià)，如果二者差異較大（如22），則容易造成退火時(shí)引物模板和模板模板退火之間的競(jìng)爭(zhēng)。而在結(jié)果輸出方面，該程序也只能以圖文格式打印，無(wú)法轉(zhuǎn)換成文本格式。第三章Oligo 6.0在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個(gè)圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.0的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq圖。“Oligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。oligo的下載和安裝我就不多說(shuō)了，打開oligo相信也無(wú)需多講。打開oligo的頁(yè)面如下： 單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrlO”可打開下面的窗口，在打開的OPEN窗口內(nèi)選擇FreqSeq再點(diǎn)“打開” 選擇drosfr或者其它一個(gè)文件點(diǎn)擊“打開”，出現(xiàn)以下窗口，點(diǎn)擊“window”， 再點(diǎn)擊“Tile”，出現(xiàn)以下窗口： 圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、G和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，委鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺(jué)得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G值在5端和中間值比較高，而在3端相對(duì)低（如圖：） Tm值曲線以選取72附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為“Oligo 6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3端Frq值相對(duì)較低的片段再點(diǎn)擊Search再點(diǎn)“For Primers and probes”或使用快捷鍵F3 ， 出現(xiàn)以下窗口，點(diǎn)OK就OK了。當(dāng)然你也可以點(diǎn)擊“Prameters”和“Search Range”選擇你要的參數(shù)和你上下游引物的位置及你擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。 出現(xiàn)Search Status窗口，點(diǎn)“OK”， 出現(xiàn)Primer pairs窗口，代表引物對(duì)的編號(hào)，依次為引物對(duì)