基因工程實驗操作技術(shù).doc

總RNA的提?。═rizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。1. 提取組織RNA時，每50100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細(xì)胞RNA時，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10 106個細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫1530C下放置5分鐘；3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（1530）放置23分鐘后，12000g（28）離心15分鐘；4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（1530）放置10分鐘,12000g（28）離心10分鐘；5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（28）離心5分鐘，棄上清；6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 實驗室常用DNA聚合酶有三種：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性較差，但價錢便宜，一般用于基因表達(dá)的檢測等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴增得到的PCR產(chǎn)物3端附有一個“A”堿基，如果希望直接將產(chǎn)物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，其特點是保真性極高，擴增得到的PCR產(chǎn)物為平滑末端。如果進行基因的擴增請使用此酶。1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液：TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 lMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 l 如TaKaRa EXTaqTM加4 l2.5mM dNTP mix4 l 10M Primer 上游1 l10M Primer下游1 lTemplate DNA1 lTaq或EXTaqDNA Polymerase0.25 lSterile deionized waterUp to 50lTotal50 l /SamplePyrobestTM DNA Polymerase的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5l2.5mM dNTP mix4l 10M Primer上游1l10M Primer 下游1lTemplate DNA1lPyrobestTM DNA Polymerase0.25lSterile deionized waterUp to 50lTotal50l /Sample 反應(yīng)總體積根據(jù)實際情況進行調(diào)控，可以做2050l以節(jié)約試劑； 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中； 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 50l 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)；2. 按以下程序進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實際操作中需根據(jù)具體的情況以及PCR結(jié)果而進行優(yōu)化。StepTemperature, C Time, minNumber of cyclesNote起始變性94951-31變性94950.5-225-35退火溫度比理論退火溫度大概低5C，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化退火37-700.5-2延伸70-75根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小每分鐘延伸1000bp最終延伸70-75101反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴增樣品5l，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液ReagentQuantity, for 50lof reaction mixture10One Step RNA PCR Buffer5l25 mM MgCl210l10 mM dNTP mix5lRNase Inhibitor (40 U/l)1lAMV-Optimized Taq1lAMV RTase XL (5 U/l)1l上游特異Primer (20 M)1l下游特異Primer (20 M)1l實驗樣品RNA（1 g Total RNA）1lRNase Free dH2O24lTotal50l /Sample1. 反應(yīng)總體積根據(jù)實際情況進行調(diào)控，可以做2050l以節(jié)約試劑；2. 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；3. 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 50l 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)；2 按以下條件進行反應(yīng)StepTemperature, CTime, minNumber of cyclesNote逆轉(zhuǎn)錄50301逆轉(zhuǎn)錄酶失活9421變性940.525-35退火37-650.5退火溫度比理論退火溫度大概低5C，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化延伸72根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小Taq酶每分鐘延伸1000bp最終延伸72101反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴增樣品5l，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。瓊脂糖核酸電泳1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2. 根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般2030 ml）；3. 放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4. 室溫下3045分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；6. 在DNA樣品中加入10體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60100V電壓，電泳2040min即可；8. 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；9. 電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。 瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000膠回收純化DNA1. 瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；2. 按照每100mg加400l的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，4555溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；3. 取出純化柱，將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；4. 加500l的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；5. 重復(fù)操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；6. 將純化柱放入一個新的EP管。加3040l H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37或50下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20保存。7. 注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100l液量加400l的binding buffer,其余的步驟不變。大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。1. 取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細(xì)菌沉淀盡量干燥；2. 將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100 l溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，劇烈振蕩；3. 加入200 l新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內(nèi)表面與溶液II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；4. 加入150 l預(yù)冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，蓋緊EP管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上35分鐘；5. 在最大轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一新EP管；6. 用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘；7. 小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；8. 加1ml 70乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內(nèi)沒有可見的液體存在（510分鐘），用適量的ddH2O溶解；9. 用0.5l的RNase 37溫育510分鐘；10. 電泳鑒定。乙醇沉淀DNA1. 加入1/10體積的乙酸鈉（3 molL，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 molL；2. 加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20中1530分鐘；3. 12,000 g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4. 加入1/2離心管容量的70乙醇，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5. 于室溫下將開蓋的EP管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干；6. 加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。酶 切1. 酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer。2. 在離心管中加入如下成分：10Buffer 1l 待切樣品 xl酶 0.5-1l 加水補足10l3. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。4. 將離心管置于37中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時間適當(dāng)延長。5. 用未酶切的質(zhì)粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時，可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應(yīng)。）連 接1. 連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。2. 在離心管中加入如下成分：10連接Buffer 1l 待連接的樣品（膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，載體與片段的mol比為13-5）連接酶0.5-1l 加水補足10l3. 混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。4. 將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r間（根據(jù)不同公司的酶的要求而定，一般為22 1-3hr或16連接過夜）。連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化，也可放4冰箱短期保存。感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 挑取適當(dāng)菌株的E.coli 單菌落接種于2ml SOB培養(yǎng)液中，37搖床過夜。2. 取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50ml SOB中，18劇烈震蕩，直到A600達(dá)到0.6。3. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4 4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。5. 取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15ml TB（1/3體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10-15min，4 4,000rpm/min離心10min。6. 棄上清，沉淀重懸于4ml TB（1/12.5體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10min。7. 加入280l DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。8. 將菌液分裝于EP管中，-80或液氮凍存。9. 取兩管感受態(tài)細(xì)胞分別加入1l無菌ddH2O（陰性對照）和1l純質(zhì)粒（陽性對照）進行轉(zhuǎn)化（見后），以檢測感受態(tài)的質(zhì)量。陰性對照平板上應(yīng)該無菌落生長，陽性對照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。SOB的配制：蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.58gKCl 0.186g100Mg+溶液 10ml溶解并加水定容至1L，12120min高壓蒸汽滅菌100Mg+溶液： MgCl26H2OMgSO47H2O溶解并加水定容至100ml，12120min高壓蒸汽滅菌TB溶液的配制： 1M KCl 5ml0.55M MnCl2 2ml0.5M CaCl2 0.6ml0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2mlddH2O 10.4mlTotal 20ml注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制： 稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此時粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固體調(diào)節(jié)PH值，只有當(dāng)PH接近6.7時粉末才能完全溶解，此時當(dāng)小心少量地加入KOH直至達(dá)到所需PH值。轉(zhuǎn) 化1. 取100l感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化。2. 加入1l純質(zhì)粒或連接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，冰浴30 min。3. 將菌液放入42水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2 min。4. 加入0.9ml SOC，于37恒溫?fù)u床上200rpm1hr溫育。5. 將菌液4000rpm/min離心3min，留200l上清將菌體打散，均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的瓊脂平板表面，平板于37倒置培養(yǎng)過夜。i. 注：新倒的平板可于37培養(yǎng)箱中預(yù)先放置數(shù)小時至過夜干燥。ii. 當(dāng)轉(zhuǎn)化的是TA克隆連接產(chǎn)物時可在菌液中加入8l 1M IPTG和40l 20mg/ml X-gal以進行藍(lán)白斑篩選。重組子的篩選和鑒定重組子可通過酶切進行鑒定，也可以利用擴增引物通過PCR進行鑒定，陽性重組子能切出所需要的片段或得到相應(yīng)片段的PCR產(chǎn)物。1. 用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖床培養(yǎng)過夜。2. 次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm3min離心，棄上清，加入20l ddH2O和20l 酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm5min離心。3. 取上清進行瓊脂糖電泳，加入載體質(zhì)粒DNA作為陰性對照，根據(jù)質(zhì)粒大小初步篩選重組子，重組子的泳動速度應(yīng)該慢于載體質(zhì)粒。4. 用堿法小量制備可能是重組子的質(zhì)粒DNA。5. 選取適當(dāng)?shù)拿?，對重組子進行酶切分析，酶切體積均為10l體系。酶切樣品進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。6. 酶切分析正確的重組子分成兩份，一份進行測序反應(yīng)，另外一份保種。7. 若用PCR法鑒定，則在第2步時每個樣本取0.5-1.0l 菌液為模板進行PCR反應(yīng)，每管反應(yīng)體系最低可少至10l，PCR產(chǎn)物電泳，能得到所需條帶的樣本進一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測序。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染該操作以Invitrogen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE為例，其它轉(zhuǎn)染試劑可參照各自的使用說明書進行。1. 在6孔板中接種1-3105細(xì)胞/孔，加入2ml完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37培養(yǎng)過夜。2. 待細(xì)胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：i. 溶液A：將1-2g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到100l無血清培養(yǎng)基中ii. 溶液B：將2-25l LipofectAMINE稀釋到100l無血清培養(yǎng)基中3. 混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。4. 用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37孵育2-24hr。5. 用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)。6. 24-72hr后檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩(wěn)定表達(dá)株。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選1確定抗生素作用的最佳濃度：不同的細(xì)胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗，確定抗生素對所選擇細(xì)胞的最低作用濃度。1) 提前24小時在96孔板或24孔板中接種細(xì)胞8孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2孵箱中37培養(yǎng)過夜。2) 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000g/ml）。3) 培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800g/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時可比該濃度適當(dāng)提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.2轉(zhuǎn)染按前面的步驟進行。3轉(zhuǎn)染72小時后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代，換為含預(yù)試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細(xì)胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中,長滿后再轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。2) 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋（10-210-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，7-10天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。4. ELISA或Western blot檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、復(fù)性和定量按Qiagen公司的操作手冊進行，具體步驟如下。一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)1. 挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml 選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)過夜。2. 次日將培養(yǎng)過夜的菌液500 l再接種于10 ml（1:20）選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)至光密度（OD600=0.6）時，取1 ml樣本作為誘導(dǎo)前標(biāo)本，10000g離心1 min收集菌體沉淀，20 oC凍存?zhèn)溆谩?. 加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG終濃度為1 mM，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)45小時。取1 ml樣本作為誘導(dǎo)后標(biāo)本，同上法收集菌體沉淀，20 oC凍存?zhèn)溆谩?. 將誘導(dǎo)前后菌體沉淀用20 40 l PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的2SDS上樣緩沖液，煮沸加熱5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色3小時后，脫色觀察結(jié)果。5. 選取誘導(dǎo)成功的細(xì)菌克隆，擴大誘導(dǎo)規(guī)模，收集菌體沉淀，于20 oC保存，準(zhǔn)備做下一步分析及純化。二、重組蛋白質(zhì)的分離純化重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定1. 將按上法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體重懸于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在80 oC低溫冰箱中放置10 min。2. 冰中解凍。3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V。4. 10000g，4oC，離心20 min，取上清（為溶液A），20 oC保存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B），同樣20 oC保存，供后繼分析使用。5. 將上述A、B溶液和誘導(dǎo)前后的細(xì)菌進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)位于A溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在B溶液中，則為非可溶蛋白。重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化1. 將菌體沉淀溶于適量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。2. 10000g，4 oC，離心30 min，收集上清液。3. 將Ni-NTA Agarose充填柱子，并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統(tǒng)，用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，調(diào)節(jié)A280值至零線。4. 將適量上清液上樣到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer沖洗至A280值低于0.01。5. 分別用510倍柱體積的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A280值低于0.01。6. 用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質(zhì)，在A280值監(jiān)測下，收集出現(xiàn)峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用0.01PBS透析，透析后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用BIO-RAD公司蛋白質(zhì)定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質(zhì)的含量。腫瘤細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)及保種一. 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)將液氮或-80oC保存的腫瘤細(xì)胞于37oC 水浴, 快速溶化, 用8.0ml培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液, 于1500轉(zhuǎn)/分, 離心3分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀, 再1500轉(zhuǎn)/分, 離心3分鐘, 棄上清, 細(xì)胞沉淀用1.0ml培養(yǎng)基混勻, 備用。 另取一個75cm2方瓶, 加入14.0ml培養(yǎng)基質(zhì), 將上述制備的含腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37oC，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長, 大約34 天細(xì)胞基質(zhì)會變黃, 5.0ml細(xì)胞懸液可傳代一個方瓶培養(yǎng), 可用34個方瓶培養(yǎng), 一個方瓶中呈對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞可達(dá)11.5107 個, 根據(jù)試驗所需, 可決定傳代的次數(shù)。 若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生長, 經(jīng)過34天, 腫瘤細(xì)胞生長至80%95% 單層時, 棄上清, 用0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細(xì)胞大約 35分鐘, 用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時, 即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中, 于1500轉(zhuǎn)/分下，離心3分鐘, 棄上清, 加少許培養(yǎng)基混勻, 可傳代3個75cm2方瓶擴大培養(yǎng)。二. 細(xì)胞凍存 將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞用1個75cm2 方瓶按上述方法收集, 于1500轉(zhuǎn)/分 離心3分鐘,棄上清, 用保種液(含10% DMSO的小牛血清)3.0ml混勻, 分別加入到23只保種管中, 寫上腫瘤細(xì)胞名稱, 時間, 保種者姓名, 放-80o C 保存, 次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存(注: -80o C下可保存細(xì)胞半年至一年, 液氮可保存細(xì)胞510年, 甚至更長的時間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌( 121oC, 30分鐘)，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)除菌, 所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù), 避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。腫瘤動物模型的建立將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞收集, 用無血清基質(zhì)10.0ml, 于1500轉(zhuǎn)/分, 離心3min, 連續(xù)洗3次, 最后用無血清基質(zhì)混勻, 用血球計數(shù)器計算腫瘤細(xì)胞數(shù)量(平均5個中方格的細(xì)胞計數(shù)104 即是腫瘤數(shù)/毫升)。 計算完腫瘤細(xì)胞總數(shù), 再將腫瘤細(xì)胞密度調(diào)至4106 個/ml, 每只小鼠腋下接種50ul(即2105個腫瘤細(xì)胞), 2周左右可捫及腫瘤小節(jié)結(jié)。一般選取68周的小鼠，不同的腫瘤細(xì)胞接種的數(shù)量和動物不一樣, 比如LL/2, B16, Hepa 可接種C57和BALB/C 小鼠, NS-1, EL-4, C26, Meth A可接種BALB/C 小鼠, H22接種昆明鼠。從腫瘤接種后可捫及小結(jié)節(jié)開始, 每3天用游標(biāo)卡尺量腫瘤縱橫大小(單位: mm), 至少連續(xù)一個月時間。注意要設(shè)計不同的實驗組和對照組, 每組動物數(shù)一般為510只, 一般接種腫瘤68周后，小鼠的腫瘤可生長至直徑為1520mm (即小鼠會瀕臨死亡)時, 可眼球取血，分離血清并保存血清, 處死小鼠, 取腫瘤組織照相, 取部分腫瘤組織作冰凍組織切片(或-80 保存), 作相應(yīng)的免疫組織化學(xué)染色, 取部分腫瘤組織用3%中性的甲醛固定, 石臘包埋, 作常規(guī)HE染色.小鼠尾靜脈注射方法在靠近實驗臺邊緣處, 用大培養(yǎng)皿扣住小鼠, 左手抓住小鼠尾巴, 用酒精棉球擦尾巴, 可見到兩側(cè)靜脈; 注射前應(yīng)確認(rèn)針管內(nèi)無氣泡, 注射時由尾尖開始, 順向刺入。失敗后再逐漸移向根部重刺, 若準(zhǔn)確刺入靜脈內(nèi), 推進時無阻力, 一般可注入0.10.5ml。腫瘤蛋白疫苗預(yù)防性動物實驗 一般腫瘤蛋白疫苗首次免疫劑量10ug/只小鼠, 與相應(yīng)佐劑混勻, 在背部皮下注射, 第2次免疫間隔2周, 同樣加佐劑在皮下注射； 第3次免疫間隔2周, 同樣加佐劑在皮下注射；第3次免疫后2周, 用ELISA檢測其血清效價，當(dāng)效價達(dá)到要求時；在接種腫瘤細(xì)胞前3天,于腹腔或尾靜脈加強注射20ug /只。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）培養(yǎng)1. 將15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。（注：4下最多貯存24小時，室溫下不超過6小時，否則廢棄）2. 用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的PBS溶液沖洗3-5次，將污血沖洗干凈為止。3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時上下?lián)u動臍帶。4. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個50 ml無菌離心管中，用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。5. 將收集液離心（2000轉(zhuǎn)/分）3分鐘。6. 倒去上清，加入10ml M199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF），用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)。（注：每個培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無菌的1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液完全鋪滿瓶底，放入37孵育，最少2小時，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被有利于細(xì)胞貼壁。）7. 培養(yǎng)24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入10 ml新鮮的 M199培養(yǎng)基。8. 以后每2天換一次培養(yǎng)基（每次換掉2/3的培養(yǎng)基）。9. 一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長滿至80-90%單層，這時可以傳代。10. 倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。11. 用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個50 ml無菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。12. 倒掉上清,加入10ml新鮮培基,一般一瓶細(xì)胞可傳代3-4瓶.以后照此傳代培養(yǎng).13. 一般傳代2-3代（培養(yǎng)了20天左右）用于做各種實驗效果最好。實驗動物免疫方案1、抗原: 蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞器、細(xì)胞、組織等。2、免疫方式：皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌肉注射等。3、不同動物免疫所需抗原量（以蛋白免疫為例）18-20kDa 18-20kDa動物 抗原量 最佳抗原量 抗原量 最佳抗原量兔子 20-200 100 50-400 200小鼠 2-40 15 4-60 40大鼠 10-50 30 20-150 50綿羊 100-1000 200 200-1000 400母雞 20-200 100 50-400 200單位：微克4、免疫方案（以免疫兔子為例）：天數(shù) 0 14 28 38 56 66 87注射 x x x x采血 2ml 2ml 2+20ml 2+50-70ml5、注意： 第一次免疫用完全佐劑與免疫原混合，以后加強免疫用不完全佐劑與免疫原混合，采取多點，時間間隔式免疫法。 如果用細(xì)胞免疫兔子，那么每次免疫所需細(xì)胞量為2-3 x 107 cells。 在連續(xù)免疫完三次后，需要少量取血進行ELISA檢測，檢測所免疫動物的抗體滴度，一般滴度能達(dá)到1:10,000-50,000。在處死所免疫的動物前一周應(yīng)加強一次免疫。 如果用小鼠免疫，可以尾靜脈小量采血（大約50l），最后取眼球大量采血（大約500-1000l）；如果用兔子免疫，可以耳緣靜脈小量取血(大約2mL)，最后心臟大量取血(50-100mL) 按血清制備的標(biāo)準(zhǔn)方法將血清分離，并且分裝成小份，儲藏在-80oC。血清制備1. 取血后，37oC下，讓血液凝固1到2小時（不加抗凝劑）；2. 4oC冰箱過夜（讓血塊固縮）；3. 當(dāng)血清自然析出后， 4oC，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，分離血清，棄去不溶物；4. 將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，儲藏在-80oC。ELISA一、包被抗原1. 用50mM的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 g/ml，加100 l/孔到96孔酶標(biāo)板，4 oC放置過夜。2. 第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時。3. PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC孵育2小時。4. PBST洗滌5次后，加入100l稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37 oC孵育1小時。5. PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。二、包被細(xì)胞1. 在96孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為1 x 104 cells/well，37過夜培養(yǎng)。2. 第二天用PBS洗滌培養(yǎng)板2-3次。3. 加入125 l/well 10% Formalin（1:10稀釋）, 室溫下固定15 min。4. 用ddH2O洗滌培養(yǎng)板3次，并晾干，儲藏在2-8oC備用。5. 用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時。6. PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC孵育2小時。7. PBST洗滌5次后，加入100 l稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗,37 oC孵育1小時。8. PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。l 50mM的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。l ABTS作為底物進行顯色反應(yīng)(10ml)： 0.2M Na2HPO4 2.4ml 0.1M 檸檬酸2.6ml ddH2O 5ml ABTS 5mg H2O2(30%) 4 ul（用前加入）注 意： 一般做倍比稀釋進行檢測，需要有相應(yīng)的對照血清。 不同的顯色系統(tǒng)對應(yīng)不同的光吸收值。血清學(xué)篩選克隆新抗原/新基因一、E.coli/ phage 裂解液預(yù)吸附血清1. 將E.coli /phage lysate以1:10-20稀釋在TBST溶液中。2. 將4張82mm的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀釋后的E.coli/ phage lysate中，室溫下水平搖動30分鐘，取出NC并使膜瀝干。3. 用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。4. 用濾紙輕輕吸去膜上的液體。5. 將膜放入50ml封閉液中，室溫下水平搖動最少30分鐘。6. 將膜從封閉液中取出，用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。7. 將血清按1:5稀釋在TBST溶液中，將一張膜放入溶液中，37下輕輕水平搖動10分鐘。8. 從血清稀釋液中取出膜并丟棄,加入另外一張新膜,37下輕水平搖10分鐘.9. 重復(fù)步驟8，直至所有4張膜都處理完。10. 除去最后一張膜，收集血清（primary antibody），分裝成小份儲存于-80冰箱中待用。注意： 該步處理過程是為了去除血清中能與細(xì)菌和噬菌體裂解蛋白進行免疫反應(yīng)的抗體，這樣可以減少假陽性率； 一抗不能反復(fù)凍融，化凍后不要再次冰凍，可放于4作短暫保存； 可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，則需要至少10個病人血清進行混合；二、噬菌體篩選1. 準(zhǔn)備NZY agar plates（至少用前24小時倒好），用前在37培養(yǎng)箱中烘烤1-2小時以去除水滴。2. 將過夜培養(yǎng)的XL1-blue MRF細(xì)菌2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，將細(xì)菌溶解在10mM MgSO4中，調(diào)整細(xì)菌濃度為OD600=0.5。3. 融化NZY top，并將NZY top放在50水浴中。4. 將適量的XL1-blue MRF細(xì)菌溶液與一定稀釋度的phage文庫混合，37下共同作用15分鐘。 直徑90mm平板：200l XL1-blue 細(xì)菌+適量的phage文庫 直徑150mm平板：600l XL1-blue 細(xì)菌+適量的phag文庫（噬菌斑數(shù)量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）5. 將步驟4中的混合液與NZY top溶液混合（200l混合液+3-4mlNZY top溶液；600l混合液+8-10 ml NZY top溶液），倒入到NZY agar plates中，室溫下放10分鐘左右，然后倒置放于37下培養(yǎng)。6. 當(dāng)噬菌斑剛好可看到時（大約5-8小時），從培養(yǎng)箱中拿出平板。7. 將NC放入10mM IPTG溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好3個不對稱的標(biāo)記。8. 將IPTG處理好的NC貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于37下培養(yǎng)。9. 過夜培養(yǎng)后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，注意不要將培養(yǎng)基粘在膜上。10. 將膜放于50ml TBST溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜3次，每次10分鐘。11. 將膜放入50ml封閉液中，水平搖動，封閉4-6小時。12. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊囊豢?，水平搖動處理過夜。13. 將膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分鐘。14. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊亩梗ǜ鱾€公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動1-2小時。15. 將膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分鐘，最后用50ml TBS溶液洗膜15-20分鐘，取出膜空氣中瀝干。16. 將膜放入BCIP-NBT顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點可見為止。17. 從顯色液中取出膜放在TBS溶液中，空氣中使膜干燥。18. 根據(jù)所做的標(biāo)記,將膜與平板對齊,將平板上對應(yīng)的陽性克隆區(qū)域的培養(yǎng)基挖出放入500l SM buffer中,并加入25 ml chloroform,4貯存（最多可貯6月）。19. 第一輪篩選得到陽性克隆需要進行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選，只不過用直徑90mm平板；具體過程見步驟4，這時所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清（見步驟18），在用前要滴定好噬菌體的滴度，噬菌斑的數(shù)量以可區(qū)分出單個克隆，同時密度不能太稀為標(biāo)準(zhǔn)（一般100-200 pfu/90mm）。20. 按第一輪相似的過程進行實驗，最后顯色，確定真正的陽性克隆，并將陽性單克隆所在的培養(yǎng)基挖出放入500l SM buffer中，并加入25 ml chloroform，4貯存（最多可貯存6月）。注意： 封閉液一般可用：5%的脫脂牛奶或1%的BSA溶解在TBST溶液中。 第一輪篩選用150mm的平板；第二輪篩選用 90mm的平板，一般需要篩選至少1 x 106 pfu。 認(rèn)真做好三個不對稱的標(biāo)記，特別在第二輪挑選陽性克隆時要仔細(xì)將膜與平板吻合好，不能挑錯。三、單克隆剪切1. 取第二輪篩選得到的陽性克隆貯存液上清。2. 將過夜培養(yǎng)的XL1-blue MRF細(xì)菌2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將細(xì)菌溶解在10mM MgSO4中，調(diào)整細(xì)菌溶度到OD600=1.0。3. 在一個EP管中加入：200l XL1-blue MRF細(xì)菌+250ul phage stock（步驟1）+1 ul ExAssist helper phage。4. 將以上三種樣品混合，37下共同保溫15分鐘。5. 將樣品混合物加入到3 ml LB培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)3-4小時。6. 將試管放于65-70水浴20分鐘，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘。7. 將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，已發(fā)生剪切的phage particles在上清中（上清可在4下儲存1-2月）。8. 將100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37保溫15分鐘。9. 取步驟8中溶液5-10 ul涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），過夜培養(yǎng)。10. 第二天細(xì)菌長出，隨機挑取單克隆接種到LB-amp培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。11. 過夜培養(yǎng)細(xì)菌分為三部分：（1）提取質(zhì)粒做雙酶切，鑒定外源基因的大??；（2）送樣品進行DNA測序（3）加入30-40%的甘油進行保種，分裝成小份儲存于-80備用。附錄：1、SM buffer (1L):(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)2、AP-buffer:(100 mM Tris HCI (pH 9.5); 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2)3、10xTBS（1L）：（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl）4、LB Broth（1L）：（10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract）ELISPOT1. PBS溶解抗原為30 g/ml，加100 l/孔于PVDF膜鋪底的96孔滅菌板過夜；2. 第二天吸去包被液后，加5FCS的PRMI 1640培養(yǎng)基100 l封閉1小時，37 oC；3. 準(zhǔn)備脾細(xì)胞懸液（用氯化銨去除紅細(xì)胞，制備成單個脾淋巴細(xì)胞懸液）；4. 從1 106/孔開始，按1:3的稀釋度開始逐孔稀釋做不同濃度梯度，并做3個復(fù)孔，37 oC靜置培養(yǎng)5小時；5. PBS洗35次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min；6. PBS洗35次，鏈親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶孵育30 min；7. PBS洗35次，用底物BCIP/NBT顯色，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，顯色后及時終止反應(yīng)；8. 計數(shù)每孔中的斑點數(shù)目，計算每106個脾細(xì)胞中抗體分泌細(xì)胞數(shù)量。藻酸鹽包裹實驗1. 將藻酸鈉溶于無菌生理鹽水，終濃度為1.5%；2. 收集培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基洗滌1次，將細(xì)胞沉淀重懸于1.5%藻酸鈉溶液中；3. 將上述腫瘤細(xì)胞懸浮液用1 ml加樣槍緩慢滴入磁力攪拌的250 mM CaCl2溶液中，形成乳白色的藻酸鹽小珠。繼續(xù)靜置于250 mM CaCl2中30 min即可使用。以上操作步驟均在無菌條件下進行；4. 將第4次免疫后7天的小鼠用苯巴比妥鈉0.1ml (按100 mg/kg計) 腹腔