谷氨酸生產(chǎn)菌及擴(kuò)大培養(yǎng).ppt

三谷氨酸生產(chǎn)菌及擴(kuò)大培養(yǎng) 教學(xué)內(nèi)容 1 了解谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 特點(diǎn) 2 掌握菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)方法 3 了解影響生產(chǎn)菌生長(zhǎng)的主要因素 教學(xué)目的與要求 學(xué)時(shí) 4 作業(yè)安排 小論文 前言 一 谷氨酸菌種的選育進(jìn)展 1 應(yīng)用常規(guī)育種技術(shù)及其所選育的谷氨酸高產(chǎn)新菌種 前言 2 谷氨酸生產(chǎn)菌抗噬菌株的選育 前言 3 采用遺傳工程新技術(shù)選育谷氨酸優(yōu)良菌種 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 1 幾種斜面培養(yǎng)基保存方法 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 2 磷酸鹽緩沖液保存方法的改進(jìn) 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 3 試管熔封法保存谷氨酸菌種的研究 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 4 液氮超低溫保存谷氨酸菌種 第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征和菌學(xué)性質(zhì) 一 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬 短桿菌屬 小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌 這四個(gè)屬在細(xì)菌的分類系統(tǒng)中彼此比較接近 短桿菌屬隸屬于短桿菌科 Brevibacteriaceace 而棒狀桿菌屬 小桿菌屬及節(jié)桿菌屬則都隸屬于棒狀桿菌科 corynebacteriaceae 短桿菌科和棒狀桿菌科均屬于真細(xì)菌目中的革蘭氏染色陽(yáng)性 無(wú)芽抱桿菌及有芽抱桿菌的一大類 二 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的菌學(xué)性質(zhì) 三 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 三 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 三 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 總結(jié) 第二節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化 人們發(fā)現(xiàn) 谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)發(fā)生明顯的菌體形態(tài)的變化 實(shí)踐證明 在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)有明顯的變化時(shí) 正是產(chǎn)谷氨酸的激增時(shí)間 但在發(fā)酵培養(yǎng)基含有過(guò)剩生物素的培養(yǎng)條件下 菌體形態(tài)則沒(méi)有明顯變化 卻呈現(xiàn)耗糖 長(zhǎng)菌 不產(chǎn)谷氨酸的異常發(fā)酵 一 種子的菌體形態(tài) 斜面和一 二級(jí)種子培養(yǎng)在不同培養(yǎng)條件下 細(xì)胞形態(tài)基本相似 斜面培養(yǎng)的菌體較細(xì)小 一 二級(jí)種子比斜面菌體大而粗壯 革蘭氏染色深 多為短桿至棒桿狀 有的微呈彎曲狀 兩端鈍圓 無(wú)分枝 細(xì)胞排列呈單個(gè) 成對(duì)及 V 字形 有柵狀或不規(guī)則聚塊 分裂的細(xì)胞大小為0 7 0 9 1 0 3 4um 由于生物素充足 繁殖的菌體細(xì)胞均為谷氨酸非積累型細(xì)胞 二 谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài) 從谷氨酸發(fā)酵中菌體形態(tài)的變化來(lái)看 大致可以分為長(zhǎng)菌型細(xì)胞 轉(zhuǎn)移期細(xì)胞和產(chǎn)酸型細(xì)胞3種不同時(shí)期的細(xì)胞形態(tài) 三 谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài) 發(fā)酵前期感染噬菌體后 菌體細(xì)胞明顯減少 細(xì)胞不規(guī)則 發(fā)圓 發(fā)胖 缺乏 字形排列 有明顯的細(xì)胞碎片 嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲 拉網(wǎng) 互相堆在一起 幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞 類似蛛網(wǎng)或魚(yú)翅狀 在發(fā)酵中 后期感染噬菌體后 菌體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則 邊緣不整齊 有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西 有細(xì)胞碎片 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 1 日常菌種工作 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 育種思路 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 育種思路1 切斷或減弱支路代謝2 解除自身的反饋抑制3 增加前體物的合成4 提高細(xì)胞膜的滲透性5 強(qiáng)化能量代謝6 利用基因工程技術(shù)構(gòu)建谷氨酸工程菌株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 2 選育耐高滲透壓的菌株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 3 選育不分解利用谷氨酸的突變株 即選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 4 選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 5 選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 6 選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 7 選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到a 酮戊二酸代謝的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 8 選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 9 選育強(qiáng)化能量代謝的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 10 選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 一 應(yīng)用原生質(zhì)體融合新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 1 標(biāo)記菌株的篩選 2 原生質(zhì)體的制備 3 原生質(zhì)體的再生 4 原生質(zhì)體的融合 5 融合子的選擇 6 實(shí)用性菌株的篩選 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 二 應(yīng)用轉(zhuǎn)化法選育谷氨酸生產(chǎn)菌 所謂轉(zhuǎn)化 是指受體細(xì)胞直接吸收了來(lái)自供體細(xì)胞的DNA片段 并將它整合到自己的基因組中 從而獲得了供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象 轉(zhuǎn)化作用需要受體菌和轉(zhuǎn)化DNA 轉(zhuǎn)化既是進(jìn)行細(xì)菌遺傳分析的有效工具 亦是微生物育種的有效方法 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 三 應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育谷氨酸生產(chǎn)菌 所謂轉(zhuǎn)導(dǎo) 是指通過(guò)溫和型噬菌體為媒介 將供體細(xì)腦中的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中 從而使受體細(xì)胞獲得了供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用需要三個(gè)組成部分 即供體菌 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 受體菌 由于絕大多數(shù)細(xì)菌 包括谷氨酸生產(chǎn)菌在內(nèi) 都有噬菌體 所以轉(zhuǎn)導(dǎo)遠(yuǎn)較轉(zhuǎn)化作用普遍 又因?yàn)檗D(zhuǎn)導(dǎo)DNA位于噬菌體蛋白質(zhì)外殼內(nèi) 所以不會(huì)像轉(zhuǎn)化DNA那樣容易被外界的DNA分解酶所破壞 因此比較穩(wěn)定 轉(zhuǎn)導(dǎo)同轉(zhuǎn)化一樣 也是微生物育種的有效方法 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 四 應(yīng)用重組DNA技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 重組DNA技術(shù)也稱為基因工程 它是在分子遺傳學(xué)理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的 它綜合了生物化學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代技術(shù)和手段在離體條件下將某種生物的基因與作為載體的DNA分子連接起來(lái) 然后轉(zhuǎn)化到某一寄主細(xì)胞中 使之進(jìn)行復(fù)制并得以表達(dá) 從而使寄主菌獲得新的遺傳性狀 利用重組DNA技術(shù) 可以使編碼限速酶的基因擴(kuò)增以排除生物合成途徑中的 瓶頸 從而使谷氨酸產(chǎn)量增加 因比重組DNA技術(shù)是提高谷氨酸產(chǎn)量的一種新的有效手段 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 五 應(yīng)用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸 固定化細(xì)胞是60年代后期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù) 是通過(guò)物理的或化學(xué)的方法將細(xì)胞束縛在一定區(qū)間內(nèi)使之仍具有催化活性的固定化生物催化劑 由于它既能保持酶或微生物細(xì)胞的催化功能 又能使細(xì)胞很方便地與反應(yīng)液分離 并能進(jìn)行重復(fù)使用 所以對(duì)原材料的合理利用 縮短不必要的操作時(shí)間 防止環(huán)境污染及進(jìn)行現(xiàn)代化的工業(yè)生產(chǎn)部具有重要的現(xiàn)實(shí)意義 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 在谷氨酸生產(chǎn)中 依其代謝途徑 把不必要的代謝途徑 經(jīng)誘變阻斷了a一酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸兩條代謝途徑 切斷后 同時(shí)誘變出細(xì)胞滲漏型甘油缺陷B4 以便讓谷氨酸有效外漏 解除因代謝途徑改變后細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物谷氨酸過(guò)度積累而產(chǎn)生的反饋抑制 谷氨酸產(chǎn)量有一定提高 經(jīng)誘變篩選得到的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株B4比其出發(fā)菌株Bl提高產(chǎn)酸率18 6 和對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率提高12 3 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 1 菌株和質(zhì)粒 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 3DNA的提取與純化1 4PCR克隆pfkA基因1 5重組質(zhì)粒Ku一1的構(gòu)建及重組菌的篩選和鑒定1 6重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性1 7磷酸果糖激酶活性測(cè)定1 8糖轉(zhuǎn)化率和谷氨酸生成比較 舉例 通過(guò)基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 結(jié)果 經(jīng)基因工程改造后的B44對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率有所提高 谷氨酸產(chǎn)量有較大的提高 這主要是增大磷酸果糖激酶劑量 解除了EMP途徑中的磷酸果糖激酶的限制 以致解除了磷酸果糖激酶對(duì)已經(jīng)改造的谷氨酸整個(gè)代謝途徑的限制 故物流代謝增強(qiáng) 以致B44對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率有所提高 谷氨酸產(chǎn)量有較大的提高 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 國(guó)內(nèi)谷氨酸發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)普遍采用二級(jí)種子培養(yǎng)的流程 即 斜面菌種 一級(jí)種子培養(yǎng) 二級(jí)種子培養(yǎng) 發(fā)酵罐 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 1 斜面菌種的培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 2 一級(jí)種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 2 一級(jí)種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 3 二級(jí)種子培養(yǎng) 1 培養(yǎng)基組成 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 3 二級(jí)種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 3 二級(jí)種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 二 影響種子質(zhì)量的因素 1 培養(yǎng)基構(gòu)成 種子培養(yǎng)基要求合有豐富的氮源 足夠的生物素 少量的碳源 以利于菌體生長(zhǎng) 如果糖分過(guò)多 菌體代謝活動(dòng)旺盛 產(chǎn)生有機(jī)酸 使PH降低菌種容易衰老 2 溫度 幼齡菌對(duì)溫度變化敏感 應(yīng)避免溫度過(guò)高和波動(dòng)大 3 PH值 零小時(shí)時(shí)PH不宜過(guò)高 培養(yǎng)結(jié)束PH不宜過(guò)低 PH上升后有所下降時(shí) 培養(yǎng)時(shí)間已接近結(jié)束 4 溶解氧 長(zhǎng)菌階段對(duì)氧要求比發(fā)酵時(shí)低 溶氧水平過(guò)高 抑制長(zhǎng)菌 5 接種量 種量過(guò)少 菌體增長(zhǎng)緩慢 適應(yīng)期長(zhǎng) 培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng) 影響種子活力 但種量過(guò)大 在拼瓶操作中易引起污染 一般種且以1 左右為宜 6 培養(yǎng)時(shí)間 培養(yǎng)時(shí)間不宜太長(zhǎng) 以7 8h為好 掌握對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作為種子接入發(fā)酵罐 總結(jié) 谷氨酸生產(chǎn)的種子制備 制備過(guò)程 斜面菌種 一級(jí)種子培養(yǎng) 二級(jí)種子培養(yǎng) 發(fā)酵 1 斜面 AS1 299 培養(yǎng)基 蛋白胨1 牛肉膏1 氯化鈉0 5瓊脂2 pH7 0 7 2 培養(yǎng)基特點(diǎn) 有利于菌體的生長(zhǎng) 原料比較精細(xì) 培養(yǎng)條件 32 生長(zhǎng)18 24小時(shí) 生長(zhǎng)斜面要求 生長(zhǎng)良好 所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)3次 2 一級(jí)種子 搖瓶 培養(yǎng)條件 于1000ml三角瓶中 裝液200 250ml 32 培養(yǎng)12小時(shí) 培養(yǎng)基 葡萄糖2 尿素0 5 玉米漿2