血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳LF.ppt

實驗四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 1 掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義 2 掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的操作技術(shù) 3 熟悉電泳儀器的使用和操作 一 實驗?zāi)康?二 實驗原理 一 電泳 electrophoresis 帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極方向泳動的現(xiàn)象 電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù) 二 電泳法 利用在電場的作用下 由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小 形狀等性質(zhì)的差異 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而對樣品進(jìn)行分離 鑒定或提純的方法和技術(shù) 醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點在pH4 0 7 3之間 在pH8 6的緩沖溶液中均帶負(fù)電荷 在電場中向正極泳動 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同 所以帶電荷量也不同 此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異 因此在同一電場中泳動的速度不同 分子小而帶電荷多者 泳動較快 反之 則較慢 三 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理 定量 將染色后的區(qū)帶分別剪開 將其溶與堿液 進(jìn)行比色測定 計算各區(qū)帶的百分?jǐn)?shù) 醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu) 厚約120 m 滲透性強(qiáng) 對分子移動的阻力很弱 用其作支持物進(jìn)行電泳 具有微量 快速 簡便 分離清晰 對樣品無吸附現(xiàn)象等優(yōu)點 現(xiàn)已廣泛用于血清蛋白 糖蛋白 脂蛋白 血紅蛋白 酶的分離和免疫電泳等方面 三 實驗器材 1 電泳儀 為電泳提供直流電源 2 電泳槽 為電泳提供場所 多用有機(jī)玻璃制成 電極用鉑絲 3 血清加樣器 可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器 4 醋酸纖維素薄膜 2cm 8cm5 其它 培養(yǎng)皿 直徑9 10cm 濾紙 玻璃板 鑷子等 DYY 5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 DYY 型電泳槽 四 實驗試劑和材料 1 巴比妥 巴比妥鈉緩沖液 pH 8 6 離子強(qiáng)度0 075 稱取1 66g巴比妥和12 76g巴比妥鈉 置于大燒杯中 加蒸餾水約600ml 稍加熱溶解 冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml 置4 保存 備用 2 染色液 稱取0 5g氨基黑 甲醇50ml 冰醋酸10ml 蒸餾水加至100ml 3 漂洗液 取無水乙醇45ml 冰乙酸5ml和蒸餾水50ml 混勻置塞試劑瓶內(nèi)貯存 3 0 4N氫氧化鈉 稱取氫氧化鈉16 0g 蒸餾水加至1000ml 1 醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中10 30分鐘后 每組取醋酸纖維素薄膜1張 取時用竹鑷子夾住薄膜一端 放在折疊的濾紙中 并用它吸干表面液體 五 實驗操作步驟 一 儀器與薄膜的準(zhǔn)備 2 電泳槽的準(zhǔn)備 點樣時 先在醋酸纖維薄膜的無光澤面距一端1 5cm處 預(yù)先用鉛筆劃一條線作為點樣線 在緩沖液中浸泡10分鐘后 用濾紙吸去多余的緩沖液 用點樣器的邊緣沾上血清后 在點樣線上迅速地壓一下 使血清通過點樣器印吸在薄膜上 點樣力求均勻 見圖 此步是實驗的關(guān)鍵 醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖 虛線處為點樣位置 二 點樣 將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上 點樣面朝下 另一端平貼在陽極端支架上 見下圖 要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直 中間不能下垂 連接好電泳儀 在室溫下電泳 打開電源開關(guān) 調(diào)節(jié)電壓為100伏 電泳時間1hr 電泳后 調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零 關(guān)閉電泳儀切斷電源 醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1 濾紙橋2 電泳槽3 醋酸纖維素薄膜4 電泳槽膜支架5 電極室中央隔板 三 電泳 電泳完畢后將薄膜取下 直接浸于氨基黑10B的染色液中 染5min取出 將薄膜從染色液中取出后用水沖洗后 依次在第一 第二 第三漂洗液中漂洗 最后再用清水漂洗一遍 直至可清晰分辨出5條色帶 取出薄膜放在濾紙上 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖 四 染色與漂洗 漂洗完畢后將薄膜取出 放在濾紙上 將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺 形狀 大小及相對位置進(jìn)行描述 記錄在預(yù)習(xí)本上 并判斷分析其結(jié)果 五 記錄和分析實驗結(jié)果 六 注意事項 1 薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一 2 點樣時 應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去 吸水量以不干不濕為宜 3 點樣時 動作要輕 穩(wěn) 用力不能太大 以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果 4 點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上 點樣量要適量 不宜過多或過少 5 電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳槽的負(fù)極端 且點樣面向下 6 應(yīng)控制染色時間 時間長 薄膜底色不易脫去 時間太短 著色不易區(qū)分 或造成條帶染色不均勻 必要時可進(jìn)行復(fù)染 附 臨床意義 血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分 含量為60 80g L 絕大部分由肝臟合成 僅 球蛋白由漿細(xì)胞合成正常值 白蛋白57 72 1球蛋白2 5 2球蛋白4 9 球蛋白6 5 12 球蛋白12 20 血漿蛋白的主要功能 維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值 維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質(zhì) 代謝物 激素 藥物及金屬離子等免疫作用 肝炎 白蛋白 a1 球蛋白 a2 球蛋白 球蛋白下降 球蛋白升高